面向隐结构模型和网络药理学探讨“调肝守恒、化浊解毒”治疗慢性胃炎的潜在生物学机制＊

徐伟超 ，李博林 ，贾文文 ，李佃贵 ，刘建平 ，郎晓猛 ，杜 姚 ，才艳茹 ，杜朋丽 ，赵丹阳 ，杨 倩 ＊＊

（1. 河北省中医院 石家庄 050011；2. 河北省中西医结合胃肠病研究重点实验室 石家庄 050011）

慢性胃炎患者多数并无症状，难以获得精准、确切流行病学资料，目前我国基于内镜诊断的慢性胃炎患病率已接近90%，推测患者数以亿计[1]。慢性胃炎患者的胃癌、肠道肿瘤、胰腺癌患病率均较一般人群增高，具有较高癌变风险[2]。慢性胃炎伴上皮内瘤变是其典型代表，癌变率达0.25%-6%[3]，成为危害我国人民身体健康和降低生活质量的主要慢性疾病之一。几千年临床实践证明，运用祖国医学“人病共存”“以平为期”先进理念与方法学治疗慢性疾病优势明显。慢性胃炎多归属于中医“胃痛”“胃痞”“吐酸”“嘈杂”等范畴，以症状诊断命名，分为本虚、标实两种病机，多从气机、湿热、气虚、阴虚、瘀血等方面论治，形成了诸多名老中医特色用药与诊疗经验[4]，如何正确诠释名老中医治疗经验，快速、有效明确慢性胃炎中药药效物质基础及可能靶点，成为中医药有效治疗慢性胃炎亟待解决的科学问题之一。

作为数据分析的经典方法之一，隐结构模型在中医临证梳理中具有重要的数据量化与诠释作用，有广阔的应用前景[5]。团队前期运用隐结构模型分析方法（图1），诠释研究团队“调肝守恒”治法，方证结合：香附、白芍、川芎、延胡索、黄连、白术、豆蔻、藿香、半枝莲、白花蛇舌草等组成，具有调肝守恒、化浊解毒之功，用于胃脘痞闷、疼痛、嗳气、纳呆、口干口苦、大便粘腻不爽等。团队前期基础已证实，该治法组方对多种脾胃疾病具有很好的临床疗效[6-7]。

网络药理学集合整体、动态、分析于一体，是融合系统生物学、药理学、中药药理学、分子生物学、计算机学为一体的新兴交叉学科，可构建“药物-活性成分-靶点-疾病”多层生物信息网络，揭示疾病-药物隐性关系。对于中药复方可提供多层次、多成分、多靶点的研究视角，为中医药经验医学的可视化、数据化研究提供方法学支持[8-9]。“调肝守恒”治法作为面向隐结构模型挖掘结合名老中医经验诠释的创新治法，目前还未见到相关网络药理学研究报道。如何从大规模、复杂的多维临床数据中发现较优的中医治疗方剂，并分析方剂可能的作用机制，成为临床策略形成与验证的重要课题，也是辨证论治临床评价研究的关键问题。隐结构模型和网络药理学的结合，可以较好地模拟、优化、验证中医治疗方剂，提高临证经验数据分析诠释准确性。本研究采用隐结构模型诠释名老中医思维决策，结合网络药理学搜索“调肝守恒”治法化合物和靶标蛋白，构建与分析靶标网络，筛选核心靶标，进行功能富集，探讨创新治法防治慢性胃炎潜在分子机制，以期为“调肝守恒-慢性胃炎”的临床评定实践提供部分可视化数据支持，研究方案见图2。

1 材料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 组方有效成分的筛选

根据调肝守恒处方组成与《中国药典》2015 版[10]的药物规范名称，由香附（CYPERI RHIZOMA）、白芍（PAEONIAE RADIX ALBA）、川 芎（CHUANXIONG RHIZOMA）、延胡索（CORYDALIS RHIZOMA）、黄连（COPTIDIS RHIZOMA） 、白 术 （ATRACTYLODIS MACROCEPHALAE RHIZOMA） 、 豆 蔻 （AMOMI FRUCTUS ROTUNDUS）、藿 香（POGOSTEMONIS HERBA） 、半 枝 莲 （SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA）、白花蛇舌草（HEDYOTIS DIFFUSA WILLD）、三七（NOTOGINSENG RADIX ET RHIZOMA）、茯苓（PORIA）、百合（LILII BULBUS）、枳实（AURANTIIFRUCTUS IMMATURUS） 、木 香 （AUCKLANDIAE RADIX）、砂仁（AMOMI FRUCTUS）组成。检索TCMSP数据库（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[11]收集组方主要化学成分。按照口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，药物半衰期（HL）≥8（百合和砂仁为≥6）为条件从上述数据库中筛选出具有较高活性且可能入血的成分。

1.1.2 组方有效成分靶点的收集

利用TCMSP 数据库中的Related Targets 预测成分相关靶点；通过UniProt 数据库[12]（https://www.uniprot.org/）预处理靶点名称，得到最终中药活性成分相关靶点。

1.1.3 慢性胃炎相关靶点获取

利用GeneCards 数据库[13]（https://www.GeneCards.org/）对慢性胃炎相关靶点进行筛选。应用Uniprot 数据库对疾病靶点进行靶点-人类基因名转换后将组方主要活性成分的预测靶点与慢性胃炎相关靶点进行交集并绘制韦恩图，提取共同的靶基因。

但，在今天，传统文化也许被很多人所遗忘。试问，如今听说评书的人有多少？学习传统戏曲的又有多少？随着一代又一代大师的离去，真正懂这些的人还有多少？是的，正因如此，人们才会有着再无“且听下回分解”的遗憾。

1.1.4 中药-活性成分-靶点网络构建及分析

为了更清晰的展现药物-成分-疾病靶点之间的关系，运用Cytoscape 软件[14]构建“中药-活性成分-疾病靶点”的可视化网络图。在网络中，节点表示中药、活性成分、疾病靶点。边则代表了中药、活性成分、疾病靶点之间的相互作用关系。节点的重要程度根据自由度（Degree）进行分析。

1.1.5 靶点蛋白互作网络构建及关键靶点筛选

利用String 在线数据库[15]（https://String-db.org/）分析靶点的蛋白间相互作用（protein protein interaction，PPI），靶点信息录入数据库，物种选择“Homo sapiens”，筛选蛋白互作综合得分＞0.4作为筛选条件得到PPI 信息，将信息导入Cytoscape 软件，进行网络拓扑分析，根据Degree的数值，筛选出核心靶基因。

1.1.6 生物功能注释（GO）基因分析与基因组百科全书（KEGG）代谢通路富集分析

利用Cytoscape 软件Clue GO 插件对作用靶点进行 GO 和 KEGG 富集分析，保留P≤0.05 结果，得到可视化图片。

2 结果

2.1 网络药理学预测

2.1.1 组方中药活性成分筛选

基于OB≥30%，DL≥0.18，HL≥8（百合、砂仁为HL≥6）作为条件对方中药物进行活性成分筛选，得到59个活性成分。

2.1.2 组方中药活性成分筛选慢性胃炎相关靶点

从TCMSP 数据库中的Related Targets 预测得到232 个成分相关靶点，从GeneCards 数据库中检索“慢性胃炎”相关靶点，得到1139 个疾病相关靶点。然后将232 个成分靶点与1139 个慢性胃炎靶点进行韦恩图绘制（图3）；计中和靶点101个。

图3 组方与慢性胃炎重合的靶点韦恩图

2.1.3 药物活性成分-靶点网络建立、分析

根据药物中筛选的活性成分和作用于疾病的相关靶点，利用Cytoscape 软件构建药物活性成分-靶点网络，红色代表基因，用不同颜色表示该成分来源自某一种药物，例如黄色表示来自黄连、粉色表示来自白术、绿色表示枳实等，经过数据分析，发现茯苓、延胡索、百合三种药物的成分所对应的靶点与疾病无交集，所以在成分和靶点图中没有上述三种药物（图4）。药物活性成分中“Degree”值排前7 的分别是：槲皮素（Quercetin，MOL00098）、木 犀 草 素（Luteolin，MOL000006）、山柰酚（Kaempferol，MOL000422）、汉黄芩 素（Wogonin，MOL000173）、黄 芩 素（Baicalein，MOL002714）、川陈皮素（Nobiletin，MOL005828）、柚皮素（Naringenin，MOL004328）。

图4 组方活性成分-靶点图

2.1.4 靶点PPI 网络分析及关键靶点的筛选

基于String在线数据平台上输入疾病-处方101个中和靶点，分析后得到PPI 网络图（图5）。图中含有101个靶蛋白和1783条互作边。推测组方治疗慢性胃炎可能与蛋白激酶B1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1/3（MAPK1/3）等靶标有关。

图5 组方与慢性胃炎蛋白质相互作用核心网络图

2.1.5 作用靶点的GO富集分析

作用靶点的GO（Gene Ontology）富集分析包含生物过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）。利用Cytoscape 软件中的ClueGO 插件对101 个共同作用靶蛋白进行GO 生物功能注释，根据保留P≤0.05 的结果，并分别对前20 个数据进行可视化分析，得到（BP,CC,MF）柱状图，其中纵坐标表示富集条目，横坐标表示富集个数（图6～图8）。图6 显示疾病-处方共同作用靶点在BP 中，主要富集条目为对金属离子的反应（response to metal ion）、对氧化应激的反应（response to oxidative stress）、脂多糖应答（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）及对抗生素的反应（response to antibiotic）等。图7 显示示疾病-处方共同作用靶点在CC 中，主要富集条目为囊腔（vesicle lumen）、分泌颗粒腔（secretory granule lumen）、细胞质囊 腔（cytoplasmic vesicle lumen）、膜 筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）等。图8 显示疾病-处方共同作用靶点在MF 中，主要富集条目为磷酸酶结合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）、抗氧化活性（antioxidant activity）、支架蛋白结合（scaffold protein binding）等。

图6 组方主要作用靶点的BP柱状图

图7 组方主要作用靶点CC柱状图

图8 组方主要作用靶点MF柱状图

2.1.6 KEGG通路富集分析

将得到的通路条目、靶点信息导入Cytoscape 软件，绘制得到靶点-通路图（图9）。其中红色代表通路，绿色代表靶点，形状越大代表富集越显著。MAPK信号通路、AKT 信号通路等与组方治疗慢性胃炎的潜在靶标密切相关，体现了组方多成分、多靶点多通路对慢性胃炎起到综合治疗作用。

图9 组方作用靶点-通路图

3 讨论

我们在前期研究中发现运用多种中医治法能改善慢性胃炎中医证候疗效，提高患者生活质量，影响血清肿瘤特异性生长因子、胃癌单抗MG7 相关抗原，降低血清炎症因子水平[16，17]，但中药复方药物众多，成分复杂，效用协同，分子机制并未阐明，故研究借助网络药理学对验方作用机制进行探索性研究，结论如下：

3.1 主要成分分析

筛选出组方59 种主要活性成分和101 个成分靶点。最主要的活性成分为槲皮素（Quercetin，QT）、木犀草素（Luteolin，Lut）、山柰酚（Kaempferol，Kae）、汉黄芩 素（Wogonin）、黄 芩 素（Baicalein）、川 陈 皮 素（Nobiletin）、柚皮素（Naringenin）。QT 作为一种天然饮食类黄酮，富含于绝大多数植物类中药中，具有明显的抗氧化、抗炎作用[18]。有研究者发现，QT 可通过c-Jun/ATF2/Bcl-x L 途径增强5-氟尿嘧啶对胃癌细胞线粒体途径凋亡的诱导活性[19]。Lut 是主要存在于中药中的天然黄酮类化合物，有一定的免疫调节、抗癌、抗氧化作用[20]，有学者发现，Lut可通过HIF-1α抗胃癌细胞增殖和迁移[21]。Kae 是一种富含在化湿类中药中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等功效[22]，有研究者发现，Kae 通过激活IRE1-JNK-CHOP 信号通路诱导胃癌细胞自噬[23]。汉黄芩素具有抗肿瘤、神经保护、抗病毒、抗炎、抗氧化等药理活性[24]，研究表明其可能是通过抑制SGC-7901、ECV304 细胞不同能量代谢酶活力，减少ATP 生成，改善细胞酸性微环境，抑制胃癌细胞增殖和肿瘤血管生成发挥抑癌作用[25]。除此之外，研究证实黄芩素、川陈皮素和柚皮素对人胃癌细胞具有较强的增殖抑制作用[26-28]。

3.2 主要靶标与通路分析

在GO 功能分析中发现组方对金属离子的反应、氧化应激的反应、脂多糖应答过程的积极调节作用；通过靶点PPI 网络分析及关键靶点的筛选，发现度值较高的靶点为MAPK1/3、AKT1、Bcl、IL、BAD、IKBKB、NFKBIA、JUN、CASP9 等，从不同方面与炎症反应存在一定关系，且与其他中药复方治疗慢性胃炎报道关键靶点吻合。研究表明，AKT/MAPK 途径是保护胃黏膜的重要潜在机制，对消化道炎-癌转化进展至关重要[29,30]。目前证据证实，MAPK1/3 等可以通过促炎反应导致细胞变异[31]，AKT1 是PI3K 的靶向基因，活性成分可通过AKT1 途径增强胃癌细胞体外增殖及侵袭力，进一步证实AKT1 在胃癌的发生发展过程中的潜在作用[32]。可以预测：组方活性成分 QT、Lut、Kae、Wogonin 等可能作用于 MAPK、AKT、Bcl 而发挥药理作用。

在KEGG 道路分析中发现MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路等多条信号转录通路通过实验研究与炎-癌转化关系密切。其中，MAPK通路上游的许多因子，如RASAL1、白介素-22（IL-22）、CCDC134、NAIF1、ZIC1等，可能通过ERK/MAPK 通路影响胃癌细胞系的增殖、侵袭和迁移[33]。此外，PI3K/AKT 信号通路不仅调节肿瘤细胞的增殖与活化，还影响肿瘤细胞的侵袭、迁移、细胞外基质的降解以及肿瘤血管生成等[34]。

3.3 展望

综上所述，本研究面向隐结构模型和网络药理学探讨“调肝守恒”治疗慢性胃炎的潜在生物学机制，候选成分中QT、Lut、Kae 可能是组方发挥作用的关键成分，交集基因富集于MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路等经典炎症-肿瘤信号通路发挥作用。鉴于方法学局限性，对疾病发生、发展、传变仍有诸多不明，后期对治法、组方活性成分、作用靶点、作用通路、治疗效果进行实验室与临床验证以及知识产权转化，是课题组下一步工作重点。