桔梗汤总黄酮对慢性阻塞性肺病大鼠TLR4/TRIF/IRF3通路的影响＊

张超云，郝鹏飞，丁生晨，张仲鸣

（南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室 南阳 473000）

慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD），是呼吸系统较为顽固的常见病，其特征是持续存在的气流受限和相应的呼吸系统症状，其病理学改变主要是气道和（或）肺泡异常，通常与显著暴露于有害颗粒或气体相关，遗传易感性、异常的炎症反应以及与肺异常发育等众多的宿主因素参与发病过程；此外，与慢性支气管炎和阻塞性肺气肿等症相关的因素都可能参与COPD 的进展，持续性的咳嗽多痰、进行性的呼吸困难是COPD 临床诊断的重要指标[1]。

桔梗汤，始载于医圣张仲景的《伤寒杂病论》，方中桔梗为南阳桐柏山道地药材，俗称“桐桔梗”，具有宣肺利咽、祛痰排脓的功效，临床应用配伍甘草，可用治肺痈证，现代研究表明亦可用于COPD 的预防与治疗，王毅[2]等的研究表明，加味桔梗汤对于COPD 大鼠具有显著的改善作用，如肺组织切片显示COPD 大鼠的肺泡壁血管充血及炎性细胞浸润得到改善，肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量及淋巴细胞计数均明显降低，白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）含量表现出下降趋势。黄颖[3]等的研究结果也证实了以上结论，她还指出桔梗可为肺部炎症的治疗发挥引经增效作用，能够使清热解毒药物在肺部的治疗作用增加。这种引经增效作用机制可能与桔梗调节肺内三叶因子（trefoil factor family3，TFF3）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）有关。目前针对桔梗汤预防治疗COPD的研究基本止步于此，对于其药效物质基础及具体作用机制均不清楚。有鉴于此，本项目前期从桔梗汤中分离出桔梗汤总皂苷、桔梗汤总黄酮、桔梗汤总多糖，并考察三者对COPD 模型大鼠肺功能的影响及外周血中白细胞介素-17（interleukin 17，IL17）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、TNF-α 的影响，结果表明，桔梗汤总黄酮部位可显著改善COPD模型大鼠的肺功能，可显著降低COPD大鼠外周血中IL-17、EGFR、TNF-α 的表达，桔梗汤总黄酮可能是治疗COPD的药效物质基础之一[4]。

Toll 样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）能促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应，干扰素调节因子3（Interferon regulatory Factor 3，IRF3）是干扰素调节因子之一，与病毒感染时干扰素基因的表达密切相关，可诱导干扰素-α（interferon-α，IFN-α）和干扰素-β（interferon-β，IFN-β）刺激基因的表达，在转录水平调节TLR4 介导β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白（TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）依赖的IFN-β 的分泌，在机体抗感染免疫中发挥重要作用[5-7]。TLR4/TRIF/IRF 通路作为炎症反应的经典通路，在COPD 发病机制中发挥重要作用，为进一步阐明桔梗汤总黄酮部位的具体作用机制，本研究拟考察桔梗汤总黄酮对COPD 大鼠TLR4/TRIF/IRF3 通路的影响，为经方桔梗汤的深度开发奠定理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 级 SD 大鼠 60 只雌雄各半，体质量 200±20 g，6-8周龄，于2020年6月购自河南省实验动物中心，许可证号为SCXK（豫）2010-0002。

1.2 实验药材

桔梗饮片（Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.Dc. 批号：2020622）、甘草饮片（Glycyrrhiza uralensisFisch.批号：20200726）均采购自南阳张仲景大药房，经南阳理工学院黄显章教授鉴定为正品；盐酸氨溴索分散片（30 mg*20片，国药准字：H20100188）烟台东诚大洋制药有限公司；红旗渠烟（焦油含量：13 mg，烟气烟碱含量：1.1 mg，烟气CO含量：13 mg）。

1.3 实验试剂

大鼠IFN-α（货号：OSD-R0464）、IFN-β（货号：OSD-R0465）ELISA试剂盒，均购自欧赛德生物科技公司；兔源MyD88（货号：38-5800）、TLR4（货号：PA5-23124）、TRAM（货号：PA5-80181）、TRIF（货号：PA5-88150）、TRAF6（货号：38-0900）、IRF3（货号：PA5-82178）、P-IRF3（货号：PA5-36775），以上均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。大鼠IL-6（货号：H007）、IL-12（货号：H010）、TNF-α（货号：H052）检测试剂盒，以上均购自南京建成生物工程研究所。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，货号：L5293）购自默克化工技术（上海）有限公司。芦丁（货号：B20771）购自上海源叶生物科技有限公司。

1.4 实验仪器

低温高速离心机：德国艾本德5424R 型，自制烟熏箱，全自动酶标仪：北京普朗DNM-9802 型，动物肺功能检测系统：美国BUXCO PTF 型，全自动凝胶成像仪：上海培清JS-380A型，电泳仪：美国Bio-rad。

2 实验方法

2.1 供试品的制备

依据《伤寒杂病论》记载，称取桔梗饮片500 g，甘草饮片1000 g，以10 倍量水煎煮3 次，过滤后适当浓缩，上样于D101 大孔吸附树脂柱，而后以水洗脱4 个柱体积后，再以50%的乙醇进行洗脱，浓缩即得自制桔梗汤总黄酮部位，共计得到干膏15.37 g。然后依据2020 版《中国药典》“山楂叶提取物”中“含量测定”项下之总黄酮测定条件[8]，以无水芦丁为对照品，对所得干膏中的总黄酮含量进行测定，其中总黄酮含量以芦丁计，为82.37%。

2.2 COPD动物模型的建立

60 只 SPF 级 SD 大鼠，在适应性饲养 1 周后，随机分成6 组，每组10 只，分别设置空白组、模型组、阳性对照组（盐酸氨溴索）[9-10]、给药组（包含桔梗汤总黄酮低、中、高三个剂量）；模型组、阳性对照组、桔梗汤总黄酮给药组均采用烟熏联合气道滴注LPS的方法建立COPD 大鼠模型。具体做法是：于造模开始的第1、15、30 天对麻醉后大鼠的气道内滴入脂多糖溶液（1 mg·kg-1），滴注 LPS 的当天不烟熏；于第 2-14 天、第 16-29天和第31-49天，将其置于自制烟熏箱内烟熏（被动吸烟30支），每天2 次，间隔12h；空白组则于相同时间麻醉后滴入气道内0.2mL 生理盐水代替脂多糖溶液，并于烟熏箱内待相同时间，但不烟熏[3,11]。

造模完成后，通过动物肺功能检测仪测定COPD模型大鼠的0.3s 用力呼气容积（Forced expiratory volume，FEV0.3）、呼气峰值流速（Peak expiratory flow，PEF）、用力肺活量（Forced vital capacity，FVC），与空白组大鼠的数据相比，变化≥30%，即可视为造模成功。

2.3 给药方法

COPD 动物造模完成后，各组依据以下方法进行给药：阳性对照组动物给予盐酸氨溴索溶液（5 mg·kg-1）灌胃给药，每日1次；给药组动物给予桔梗汤总黄酮低、中、高三个剂量，将桔梗汤的临床给药量换算为大鼠的给药量，而后再根据桔梗汤总黄酮的生药含量，计算即为中剂量18.62 mg·kg-1，为方便配制记为20 mg·kg-1，则低剂量和高剂量分别为（10 mg·kg-1和40 mg·kg-1），灌胃给药，每日 1 次；空白组给予等量生理盐水灌胃，各组均累计给药3周。

2.4 检测方法

2.4.1 大鼠肺功能的检测

各组实验动物给药3 周之后，使用动物肺功能检测仪分别测定空白组、模型组、阳性对照组、给药组等各组实验大鼠的FVC、FEV0.3、PEF 值，并统计分析相关数据。

2.4.2 IL-6、IL-12、TNF-α的检测

取材前，首先通过10%水合氯醛将各组实验大鼠麻醉，等麻醉生效之后，逐步打开实验大鼠胸腔，分离各实验大鼠颈部气管并做T 型插口，再以静脉导管缓慢插入T 型插口，多次灌注累计6 mL 生理盐水，完成后立即回抽灌洗溶液[11]。分别检测灌洗溶液中IL-6、IL-12、TNF-α的含量。

2.4.3 IFN-α、IFN-β的检测

继续分离取过肺部灌洗液大鼠的腹主动脉，以10 mL 注射器朝向心端方向刺入，抽取动脉血5 mL，分离血清，根据ELISA 试剂盒说明，分别测定各组大鼠血清中IFN-α、IFN-β的含量。

2.4.4 实验动物肺组织切片观察

采用颈椎脱臼的方法处死实验大鼠，取其灌洗肺部（左肺），以4%多聚甲醛溶液固定，脱水后石蜡包埋，切片4-10 μm；之后使用二甲苯脱去石蜡，再用乙醇溶液梯度水化，烘干，采用HE 染色，光镜下观察大鼠的肺组织形态[12]。

2.4.5 Western blot检测MyD88、TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、IRF3、P-IRF3蛋白表达量

分离各组大鼠的右肺，迅速放于液氮罐中速冻，待测时称取适量，以预冷的玻璃研磨器研磨成浆，加入适量的含苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的强效RIPA 裂解液，分别提取各组实验大鼠的肺组织总蛋白，使用蛋白质定量（Bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度，于10%十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）凝胶上样，电泳，转印，最后封闭1h；再以相应的一抗于4℃冰箱孵育，24 h 后，然后以磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）进行清洗，再加入辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）标记的二抗，室温条件下孵育2 h，采用增强化学发光法（Enhanced Chemiluminescence，ECL）法显色成像。

2.5 数据分析及绘图软件

各组数据均采用SPSS22.0 软件进行统计分析，所有数据均以P＜0.05表示差异具显著性；绘图软件主要采用GraphPad Prism7.0。

3 结果

3.1 桔梗汤干膏中总黄酮的含量测定结果

3.1.1 线性关系

依照2020 版《中国药典》中“山楂叶提取物”中总黄酮的含量测定条件，所建立的线性回归程为Y=35.261X+0.0349（r=0.9995），表明芦丁对照品在 0.2-1.0 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

3.1.2 方法学考察

按照“3.1.1 项”下方法，分别进行了精密度实验、重复性实验、稳定性实验，其RSD%分别为1.21%、2.14%、1.65%，表明该方法的精密度、重复性、稳定性均良好；另外加样回收率实验的结果为：各加标回收率为 96.31%、95.75%、103.26%、104.69%、99.37%、95.95%。其平均值为99.22%，RSD 为2.77%，表明该方法的准确度良好。

3.1.3 桔梗汤干膏中总黄酮的含量

依照“2.1 项”下所示方法，分别制备6 次干膏，并分别测定其总黄酮含量，所得结果以无水芦丁计，结果为85.36±1.75%。

3.2 各组实验大鼠肺功能的检测结果

据表1 可知，模型组大鼠与空白组大鼠相比，FVC、FEV0.3/FVC、PEF 等指标均有显著降低（P＜0.05），表明造模成功。给药3 周后，阳性对照组大鼠与模型组比较，FVC、FEV0.3/FVC、PEF 等指标均有显著性差异（P＜0.05），表明阳性对照组大鼠肺功能有所改观；并且，阳性对照组与空白组大鼠相比，FVC、PEF指标没有显著性差异（P＞0.05），即该指标与正常小鼠无差异，而FEV0.3/FVC 指标具有显著性差异（P＜0.05），表明该指标仍未恢复正常。桔梗汤总黄酮低、中、高组与模型组比较，FVC、FEV0.3/FVC、PEF等指标均有显著性差异（P＜0.05），证明桔梗汤总黄酮部位对COPD 模型大鼠的肺功能有明显改善，并且桔梗汤总黄酮部位中、高剂量组实验大鼠与空白组比较，各项指标均不具有显著性差异（P＞0.05），即初步说明经过给药，COPD 模型大鼠在 FVC、FEV0.3/FVC、PEF 等相关指标方面基本恢复正常。

表1 各组实验大鼠肺功能检测结果（，n=10）

表1 各组实验大鼠肺功能检测结果（，n=10）

注：*表示与模型组相比，P＜0.05；#表示与空白组相比，P＜0.05。

PEF（L·min-1）30.2±1.5 19.5±1.7#26.8±2.0*24.5±0.8*#26.2±1.1*28.3±1.5*组别空白组模型组阳性对照组桔梗汤总黄酮低剂量组桔梗汤总黄酮中剂量组桔梗汤总黄酮高剂量组FVC（mL）9.5±0.6 5.0±0.7#8.1±0.9*6.9±0.6*#7.7±0.8*8.2±0.7*FEV0.3/FVC（%）78.3±6.1 57.3±6.5#69.1±5.4*#68.5±4.5*#69.8±7.2*71.7±6.8*

3.3 各组实验大鼠肺灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α指标的检测结果

据表2可知，模型组大鼠与空白组比较，肺灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α 显著提升（P＜0.05）。阳性对照组大鼠与模型组比较，肺灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α 均显著降低（P＜0.05），而与空白组比较，各项指标均不具有显著性差异（P＞0.05），表明盐酸氨溴索对COPD 模型大鼠肺灌洗液中炎症因子IL-6、IL-12、TNF-α 的抑制作用较强。并且，桔梗汤总黄酮低、中、高剂量组大鼠与模型组相比，肺灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α 均具有显著性差异（P＜0.05），证明桔梗汤总黄酮亦可抑制COPD 大鼠肺灌洗液中的炎症因子，另中、高剂量组大鼠与空白组比较，不具有显著性差异（P＞0.05），即初步说明经过给药，COPD 模型大鼠在IL-6、IL-12、TNF-α等指标方面亦基本恢复正常。

表2 各组实验大鼠肺灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α的检测结果（，n=10）

表2 各组实验大鼠肺灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α的检测结果（，n=10）

注：*表示与模型组相比，P＜0.05；#表示与空白组相比，P＜0.05。

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3.4 血液中IFN-α、IFN-β的检测结果

据表3 可知，模型组大鼠与空白组比较，血液中IFN-α、IFN-β 均显著升高（P＜0.05）；阳性对照组大鼠经治疗后，与模型组大鼠比较，虽然IFN-α、IFN-β 显著下降，但与空白组大鼠相比亦具有显著性差异（P＜0.05），故说明阳性药物盐酸氨溴索在抑制COPD 大鼠血液中IFN-α、IFN-β 方面的作用并不强。而桔梗汤总黄酮组实验大鼠与模型组比较，血液中IFN-α、IFN-β 的含量均显著下降（P＜0.05），且低、中、高三个剂量组与空白组比较均无显著性差异（P＞0.05），即初步说明经过给药，COPD 模型大鼠在IFN-α、IFN-β 等指标方面基本趋于正常。

表3 各组实验大鼠血液中IFN-α、IFN-β的检测结果（，n=10）

表3 各组实验大鼠血液中IFN-α、IFN-β的检测结果（，n=10）

注：*表示与模型组相比，P＜0.05；#表示与空白组相比，P＜0.05。

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3.5 各组实验大鼠肺组织病理切片结果

据图1 可知，经HE 染色后，空白组大鼠的肺部结构完整紧致，肺泡壁、支气管壁厚度正常，未见有泡腔扩张内部纤毛倒伏等情况。而由于建立COPD 模型，模型组大鼠的肺部结构严重受损，表现在肺部结构疏松稀落，肺泡壁及支气管壁变薄，界限不清，泡腔扩张严重，内部纤毛倒伏。阳性对照组大鼠肺组织情况改善明显，肺泡壁、支气管壁逐渐变厚，但仍可见有些薄弱，泡腔扩张及内部纤毛倒伏、掉落等情况明显改善；而桔梗汤总黄酮低、中、高三个不同剂量组实验大鼠的各项表现也有一定的改观，尤其是低、中两个剂量组与阳性对照组接近，尽管肺泡壁、支气管壁情况有所缓解，但仍未恢复正常情况；高剂量组则显示出更好的治疗效果，其肺泡壁、支气管腔、肺泡腔大小、内部纤毛基本恢复正常。

图1 各组实验大鼠肺组织病理切片（100×）

桔梗汤总黄酮中剂量组：FPG-M，桔梗汤总黄酮高剂量组：FPG-H。

3.6 Western blot检测相关蛋白表达量变化

Western blot 检 测 MyD88、TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、IRF3、P-IRF3蛋白表达量的变化，所得结果如图2所示，模型组大鼠肺组织的MyD88、TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、IRF3、P-IRF3 蛋白表达量均异常增加，与正常组比较均具有显著性差异，表明该通路异常活跃；经阳性药物盐酸氨溴索治疗3 周后，MyD88、TLR4、TRAF6 蛋白表达量显著下降，但TRAM、TRIF、IRF3、P-IRF3 蛋白表达量的变化不具有显著性，说明阳性药物治疗COPD 可能通过TLR4/MyD88 信号通路，但不通过TLR4/TRIF/IRF3 信号通路。相反，经过桔梗汤总黄酮各剂量组治疗后，MyD88 无显著性变化，但TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、IRF3、P-IRF3 表达量均呈显著下降的趋势，且具有较好的量效关系。综合上述情况，桔梗汤总黄酮有可能是通过抑制高度活化的TLR4/TRIF/IRF3 通路，治疗或改善COPD 大鼠的症状。

图2 Western blot检测结果

4 讨论

COPD 作为呼吸系统较为顽固的常见病，与肺气肿和慢性支气管炎密切相关，其临床的主要诊断依据为持续性的气流受限。临床研究表明，中药复方对其具有一定的治疗效果，可为现有的治疗方案提供新的思路，近年来，桔梗汤在此方面的作用备受科研人员关注，已有的报道多在临床或动物实验中证实其疗效，但桔梗汤治疗COPD 的具体作用机制尚不清楚，因而考察桔梗汤对与COPD 强相关的信号通路的影响，对经方桔梗汤的二次开发具有重要的意义[13-15]。

TLR4/TRIF/IRF 通路作为炎症反应的经典通路，在COPD 发病机制中发挥重要作用，TLRs 是一种连接固有免疫与获得性免疫的重要模式识别受体，目前已发现人源的TLRs 就有10 种之多，其中与COPD 最具相关性的即为TLR4[16]。生理状态下，TLR4 的激活既可诱导先天性炎症反应，也可发生抗原适应性免疫应答，在细菌、真菌乃至病毒的侵袭时发挥重要作用；但在病理状态下，TLR4 的高度活化，可导致其下游通路异常活跃，诱导炎症因子及气道粘液高分泌，最终推动COPD病程的进展[17]。

研究认为[18-20]，TLR4 所控制的信号传导主要有两条途径，一条是经典的MyD88 依赖性信号转导通路，另一条是MyD88 非依赖性信号转导通路。两条通路看似独立，实则有内在交联：经典的MyD88 依赖性信号通路主要通过MyD88 将TLR4 接受的信号向下传导，激活IRAKs（白细胞介素受体相关激酶），活化的IRAKs 会开启泛素连接酶6（TRAF6）开关，激活NF-κB、MAPK 等信号通路，分泌 IL-6、IL-12、TNF-α，介导炎症反应；而MyD88 非依赖性信号通路不经过MyD88和IRAKs传达信号，主要通过TRAM（易位关联膜蛋白）募集TRIF（β-干扰素TIR 结构域衔接蛋白），由 TRIF 开启 TRAF3 和 TRAF6 的开关，其中 TRAF3 可促进IRF3（干扰素调节因子-3）的磷酸化，从而增加IFN-α、IFN-β的分泌，介导炎症反应。

在本研究中，桔梗汤总黄酮可显著抑制COPD 模型大鼠肺灌洗液中的 IL-6、IL-12、TNF-α 等炎症因子，减少由它们诱发的肺部的局部炎症反应，打破“痰液-炎症-痰液”的恶性循环，改善FVC、FEV0.3/FVC、PEF 等肺功能相关治标，从而缓解因痰液-炎症导致的气流受限情况，此为“治标”；同时，桔梗汤总黄酮还可以显著降低COPD 模型大鼠血液中IFN-α、IFN-β的含量，抑制由它们介导的大鼠体内的炎症反应，有效缓解长期处于炎症浸润的肺部损伤，修复肺泡壁及支气管壁，改善肺泡腔扩张及内部纤毛倒伏的情况，从而从根本上改善气流受限，治疗COPD，此为“治本”；两者联合，标本兼治，才能受到较好的治疗效果。

另外，Western blot实验结果表明，COPD 模型组大鼠 肺 组 织 的 MyD88、TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、IRF3、P-IRF3 蛋白表达量均异常增加，与正常组比较均具有显著性差异，表明该通路异常活跃；而给予桔梗汤总黄酮治疗之后，对MyD88 蛋白的表达无明显影响，但可使TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、IRF3、P-IRF3等蛋白的表达均显著下降，即桔梗汤可显著抑制异常活化的TLR4/TRIF/IRF3通路。综上所述，桔梗汤总黄酮治疗COPD 可能是通过TLR4/TRIF/IRF3 通路发挥作用，不通过经典的MyD88依赖性信号通路。