参苓白术散通过IκBα/NF-κB通路调控Lewis肺癌小鼠肿瘤自噬的研究

张云亭，刘羽茜，蒋宗蓥，张 林，董 秀，冯晓帆，王靖宇，王艳杰

（辽宁中医药大学中西医结合学院 沈阳 110847）

近年来，有关肺癌的防治一直是医学研究攻克的重点和难点[1]。目前临床治疗肺癌常用的化疗药物主要为抗肿瘤效果显著、抗肿瘤谱广的铂类药物，但铂类药物容易引起严重的免疫功能下降、胃肠道功能降低、精神萎靡等毒副作用[2]。中药因其多靶点效应、毒副作用低、不易产生耐药性等优势逐步参与到临床肺癌的综合治疗当中。临床研究表明使用培土生金法联合化疗治疗非小细胞肺癌能够提高临床疗效，改善患者生活质量，不良反应较单纯化疗组明显减少[3]。

本课题组前期研究发现参苓白术散含药血清能通过调控 Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）表达有效的抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的SPCA1 肺癌细胞的增殖，说明在体外实验中参苓白术散能够通过调控LPS 诱导的炎症反应，从而抑制肺癌细胞的增殖[4]。炎症反应贯穿于肿瘤疾病始末的全过程，而自噬的激活能够抑制促肿瘤的炎症反应，增强抗肿瘤免疫活性。众多证据表明[5-6]，细胞自噬可以调节过度的炎症反应。肿瘤微环境中自噬与免疫的交互作用共同影响着肿瘤发生、进展[7]。参苓白术散等培土生金法中药复方能够调节机体免疫功能[8]，但是其是否能够干预肿瘤微环境中的炎症反应，从而调控自噬有待进一步研究。因此本实验通过观察参苓白术散对肺癌小鼠肿瘤细胞自噬相关蛋白Atg3、Atg5、Beclin-1 和LC3 表达的影响，及其对炎症相关通路IκBα/NF-κB 通路和促炎因子TNF-α、IL-1β 的含量的影响，为进一步探索参苓白术散联合顺铂治疗肺癌的机制提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 动物

雄性 C57BL/6J 小鼠 40 只，SPF 级，体质量 18-22 g；购于北京维通利华实验动物有限公司，合格证号SCXK(京)2016-0002。动物实验在中国医科大学实验动物部进行，动物使用许可证号SYXK(辽) 2015-0001。本研究所涉及的动物实验部分均符合中国医科大学实验动物福利伦理委员会批准，批准号IACUC.2018019。

1.2 主要药物和试剂

参苓白术散（北京同仁堂有限公司，生产批号16101054）、顺铂（齐鲁制药有限公司，生产批号1W2A1301004B）、TNF-α 和 IL-1β ELISA 试剂盒（美国 ADL 公司）、IκBα、NF-κB、Atg3、Atg5、Beclin-1、LC3B 和二抗（美国Proteintech）、SABC 试剂盒、DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；全蛋白抽提试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒、预染蛋白分子量、SDS-PAGE 凝胶电泳试剂盒、ECL 检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.3 仪器

YrdimesSW07D0567 蛋白转印仪（威泰克有限公司），EG1150C 型包埋机，超薄切片机LKB-1，HI1220型烘片机（德国LEICA），JEM-1011BX51 型OLYMPUS显微镜（日本OLYMPUS），ELITE300PLUS E5W0541基础电泳仪电源（威泰克有限公司），5415C 高速冷冻离心机（德国Eppendorf），RM2235 型手动石蜡切片机，THZ-312 台式恒温振荡器（上海精宏实验设备有限公司），DolphinChemiPlusIDPK1012012 凝胶成像分析系统（威泰克有限公司）。

2 方法

2.1 模型的建立与实验动物分组

常规培养小鼠肺癌Lewis 细胞（购自中国科学院细胞库），达到一定数量后收集细胞并计数，制作浓度为 1×107个/mL 的细胞悬液。SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠40 只，每只右侧腋窝皮下接种细胞悬液0.1 mL；待肿瘤组织形成后用游标卡尺测定瘤体的瘤长（a）和宽（b），计算肿瘤体积（tumor volume，TV），TV=1/2×a×b2，每日1 次，7 天后待肿瘤体积达到50 mm3视为Lewis 肺癌小鼠模型建立成功。建模成功后随机分成4 组，每组10 只，分别为模型组、顺铂组、中药组和中药+顺铂组。模型组给予等量蒸馏水灌胃；顺铂组给予腹腔注射顺铂（5 mg·kg-1）每周1 次，共2 次；中药组按照体表面积折算法进行人和大鼠等效计量换算，给予参苓白术散（9.36 g·kg-1）每天1 次，连续灌胃 14 天；中药+顺铂组给予参苓白术散（9.36 g·kg-1）每天1次，连续灌胃14 天，同时给予腹腔注射顺铂（5 mg·kg-1）每周 1 次，共2次。

2.2 各组小鼠肿瘤体积、相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率的测定和计算

模型建立成功后和给药第14 天分别测定小鼠肿瘤长（a）和宽（b），计算肿瘤体积（tumor volume，TV）体积，TV=1/2×a×b2，然后计算相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为 RTV=Vt/V0，其中 V0为模型建立成功后分笼给药时测量的肿瘤体积，Vt为给药14天后测量的肿瘤体积，然后计算相对肿瘤增殖率T/C（%），计算公式如下：T/C（%）=TRTV/CRTV×100%,其中TRTV为各治疗组RTV，CRTV为Lewis模型组RTV。

2.3 透射电镜观察各组肿瘤细胞超微形态变化

取肿瘤组织于干冰上修成1 mm3组织小块，先放入4%多聚甲醛固定2 h 以上，PBS 冲洗，然后1%锇酸固定2 h，PBS 冲洗。梯度乙醇、丙酮脱水，包埋，聚合。1 μm半薄切片，甲苯胺蓝染色定位，然后超薄切片，柠檬酸铅-醋酸双氧铀双染，透色电镜观察，拍照比较分析。

2.4 ELISA 法测定各组肿瘤组织中TNF-α 和IL-1β的含量

肿瘤组织按照1:9（M:V）加PBS 研磨制备组织匀浆，离心取上清，按照ELISA 试剂盒说明书进行检测，酶标仪450 nm 处测定各反应孔的吸光度值，并计算TNF-α和IL-1β的含量。

2.5 免疫组化法测定肿瘤组织IκBα 蛋白表达水平和NF-κB的入核率

切片灭活内源性酶，封闭，滴加一抗50 μL，37℃孵育2h，PBS浸洗。滴加二抗，37℃度孵育20 min，PBS浸洗。DAB 溶液显色，复染，返蓝，梯度脱水封片。光学显微镜下观察肿瘤细胞中IκBα 和NF-κB 蛋白的表达水平，细胞质呈棕黄色为IκBα 阳性表达细胞，细胞质和细胞核呈棕黄色为NF-κB 阳性表达细胞，随机选取3 个视野采用Image J 软件进行平均光密度测定，取其平均值作为该切片的代表值，并计算NF-κB P65 入核率，即细胞核阳性细胞数占总阳性胞数的百分比，取其平均值作为该切片的代表值。

2.6 Western Blot 法测定肿瘤组织 Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3II的蛋白表达水平

肿瘤组织加入1 mL预冷过的Lysis Buffer裂解液，充分研磨，离心分离上清，得到总蛋白提取物，用BCA法进行蛋白定量测定。配制分离胶和浓缩胶，上样，电泳，然后转膜，封闭。然后滴加一抗（1:500-1000），4℃摇床振荡孵育过夜。第二天TBST洗涤，滴加二抗，室温摇床振荡1-2 h，TBST 洗膜。采用ECL 化学发光显色，凝胶成像系统拍照，采用Image J 软件测定目的蛋白和内参蛋白和条带的光密度值，计算目的蛋白和内参的光密度比值，进行统计分析。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 参苓白术散对Lewis 肺癌小鼠肿瘤体积、相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率的影响

治疗前各组肿瘤体积达到0.05 cm3（50 mm3），提示造模成功，并且各组小鼠肿瘤体积无显著差异（P＞0.05）；治疗结束后，和模型组比较，顺铂组、中药组和中药+顺铂组肿瘤体积和相对肿瘤体积显著降低（P＜0.01）（表1）。中药组相对肿瘤增殖率为54.51%，中药+顺铂组相对肿瘤增殖率为42.31%，顺铂组相对肿瘤增殖率为44.77%，其中中药+顺铂组相对肿瘤增值率最低，说明中药联合顺铂治疗抑制肿瘤增殖效果最显著。

表1 参苓白术散对Lewies肺癌小鼠肿瘤体积和相对肿瘤体积的影响（，n=10）

表1 参苓白术散对Lewies肺癌小鼠肿瘤体积和相对肿瘤体积的影响（，n=10）

注：和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.2 参苓白术散对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞超微形态的影响

透射电镜结果显示模型组肿瘤细胞和细胞核结构清晰，细胞器丰富，可见少量自噬小体，顺铂组、中药组和中药+顺铂组肿瘤组织中细胞体积缩小，细胞核呈不规则形态，自噬小体数量增加（图1、图2）。

图1 各组皮下瘤体

图2 参苓白术散对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞超微形态的影响

3.3 参苓白术散对肿瘤组织TNF-α 和IL-1β 含量的影响

ELISA 结果显示（图3），和模型组比较，顺铂组、中药组和中药+顺铂组肿瘤组织TNF-α 和IL-1β 含量显著降低（P＜0.01）。和顺铂组比较，中药组和中药+顺铂组肿瘤组织TNF-α 和 IL-1β 含量显著降低（P＜0.01）。说明中药治疗和中药联合顺铂治疗降低肺癌肿瘤组织中促炎因子TNF-α和IL-1β的含量更显著。

图3 参苓白术散对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织TNF-α和IL-1β含量的影响

3.4 参苓白术散对肿瘤组织中IκBα 和NF-κB P65 蛋白表达的影响

免疫组化结果显示：IκBα 和 NF-κB 阳性细胞显示为棕色（图4）。与模型组相比，顺铂组、中药组及中药+顺铂组的肿瘤组织中IκBα 阳性细胞数量显著增加，平均光密度值显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，顺铂组、中药组和中药+顺铂组的肿瘤组织中NF-κB 阳性细胞数量显著减少，NF-κB P65 入核率显著降低（P＜0.01）。说明顺铂、中药以及中药联合顺铂能够增加 IκBα 的蛋白表达水平，而降低 NF-κB P65 入核率，从而抑制IκBα/NF-κB通路（表2）。

图4 参苓白术散对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞IκBα和NF-κB P65蛋白表达的影响

表2 参苓白术散对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞IκBα表达和NF-κB入核率的影响（，n=6）

表2 参苓白术散对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞IκBα表达和NF-κB入核率的影响（，n=6）

注：和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.5 参苓白术散对肿瘤组织中Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3蛋白表达的影响

Western blot结果显示（图5）：与模型组相比，顺铂组、中药组和中药+顺铂组的肿瘤组织中Atg3、Atg5、Beclin-1 和LC3II/LC3I 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；和顺铂组比较，中药+顺铂组LC3II/LC3I蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。结果表明参苓白术散能够增加肺癌组织中 Atg3、Atg5、Beclin-1 和 LC3II/LC3I蛋白表达水平，促进肿瘤细胞自噬，中药联合顺铂上调LC3II/LC3I蛋白表达水平作用最显著。

图5 参苓白术散对Lewis肺癌小鼠Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3蛋白表达的影响

3 讨论

肺癌在中医学范畴内属“肺积”“结癖”“息责”等，虽然病变的部位是在肺，但发病的原因与脾、肝、肾等脏腑均有关系。肺癌等肺系疾病经日久损耗后，常会出现肺气不足的情况。脾与肺为母子关系，子盗母气，则脾气也会不足，出现脾虚之症。《黄帝内经》中提到：“虚则补其母，实则泻其子。”所以可以用补脾益肺的方法治疗肺癌。参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，为培土生金方的代表方剂之一。方中人参、茯苓、白术为君药，莲子、山药、白扁豆、薏苡仁为臣药，君臣合用以渗湿健脾，补脾益肺。砂仁醒脾行气和胃、畅达气机；桔梗载药上行、宣开肺气；甘草健脾和中、调和药性，三者共为佐使药。本方用甘温药物补脾，兼能补益肺气以培土生金，对肺癌中后期造成的肺脾气虚有显著疗效。目前，参苓白术散已逐渐应用于临床肺癌的辅助治疗[9]，参苓白术散的作用机制也在逐步被研究发现[10-11]。如方中君药茯苓最主要的活性成分之一茯苓多糖，已被证实具有抗炎、抗肿瘤及提高机体免疫力等作用[12]。方中君药人参[13-14]的主要活性成分人参皂苷及白术[15]中的活性成分白术内酯等，同样被实验研究证明具有抗炎及抗肿瘤等作用。

自噬是真核生物特有的，为了维护细胞内环境稳定所进行的一种程序性细胞死亡，在肿瘤的发生、发展与治疗过程中均有体现[16]，是近年的研究热点。自噬的发生被自噬相关基因严格调控[17]。其中beclin-1是形成自噬体过程中的必需基因，同时也是重要的抑癌基因[18]。李璐等[19]研究发现在肿瘤细胞中beclin-1表达量显著降低，可以通过上调beclin-1 的表达来发挥抑制肿瘤的作用。Atg5 参与自噬泡的形成，在众多调控自噬的基因中占主要地位，在肿瘤的发生和发展中均有参与[20]。程建超等[21]发现调控Atg5的表达可以抑制肺癌肿瘤生长。Atg3 对LC3 的脂化起重要调节作用。LC3 是自噬发生的标志之一，参与自噬膜的形成并调控溶酶体和自噬体的结合[22]。当自噬发生时，活化后的LC3-I被修饰形成LC3II，经过融合蛋白的转移后，在自噬体膜上促进自噬体的成熟[23]。LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值，常被作为衡量自噬程度的标准[24]。有研究表明[25]诱导肝癌细胞发生自噬后，肿瘤细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达水平显著提高。

NF-κB 是一种诱导性的转录调节因子，可以调控基因的转录和表达，对细胞的增殖、凋亡、自噬等均有影响[26]。未被激活时，NF-κB 和其相应的抑制蛋白IκB在细胞浆中结合存在。受到外界刺激时，IκB激酶家族通过磷酸化使IκB 从无活性的三聚体中降解出来，从而激活 NF-κB 信号通路[27]。NF-κB 信号通路作为典型的炎症通路，激活后会持续刺激TNF-α、IL-1β等的表达，引起炎症反应，促使肿瘤炎性微环境持续存在，促进肿瘤细胞的生成、增殖和转移[28-29]。NF-κB的激活过程中会出现mTOR 信号通路的激活，进而抑制细胞自噬的发生。有研究表明通过抑制NF-κB 信号通路可以上调自噬蛋白的表达，促进肿瘤细胞发生自噬[30-31]。梁晓晖等[32]通过实验发现，抑制NF-κB 信号通路中相关蛋白的磷酸化，可以达到促进肿瘤细胞自噬的效果。

本实验结果显示，中药组和中药联合顺铂组中TNF-α、IL-1β 的含量均有降低，NF-κB 蛋白表达水平降低，IκBα 蛋白表达水平升高，这提示参苓白术散能够通过促进IκBα 蛋白的表达，抑制IκB 激酶家族磷酸化，来抑制NF-κB 的激活和炎症反应的发生。中药组和中药联合顺铂组中 Atg3、Atg5、Beclin-1 和 LC3II/LC3I的表达明显增加，这提示参苓白术散能够通过抑制炎症通路的激活来调控肺癌肿瘤细胞的自噬。

综上所述，参苓白术散可能通过上调IκBα蛋白表达，抑制NF-κB的激活，改善肿瘤炎性微环境，从而促进Lewis 肺癌小鼠肿瘤细胞自噬。这为临床上使用参苓白术散进行中西医结合治疗肺癌并降低机体炎症反应提供了一定的实验依据。