血清HMGB1、BNP水平参与先天性心脏病大鼠肺动脉高压发生的机制

汪毅 张晓羽 张旭光 闫志国

(昆明市第一人民医院心胸外科，云南 昆明 650051)

先天性心脏病作为先天畸形常见类型，约占全部先天畸形的20%，而心脏大血管形成障碍或发育异常，容易增加心脏负荷，导致肺循环血流量升高，加重肺脏负担，引发肺动脉高压(PH)〔1〕。据报道，PH会诱发肺小动脉反射性收缩，增加回心血量，从而进一步加重心脏负荷，引发心力衰竭〔2〕。目前，临床多采用右心导管评估PH，此检查方式虽可明确肺血管阻力情况，但有创性检查不利于临床推广〔3〕。研究指出，PH病理特征主要以血管痉挛、内膜重构等为主，而肺血管炎症免疫、血管收缩在PH病理改变中发挥重要作用〔4〕。高迁移率族蛋白(HMG)B1是一种具有特征性损伤相关分子模式的分子，可参与免疫应答、组织重构、血管再生等多种过程，且可介导内皮细胞活化〔5〕。脑钠肽(BNP)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统拮抗剂，可促血管松弛，抑制血管活性肽收缩，且可降低交感神经活性〔6〕。结合HMGB1、BNP作用机制，推测二者在先天性心脏病患者PH发生过程中发挥重要作用，但具体作用机制尚待探讨。本研究建立先天性心脏病大鼠模型，分析血清HMGB1、BNP水平与先天性心脏病大鼠发生PH的关系。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：本研究获得动物实验伦理审查批准。选取10只正常大鼠，20只先天性心脏病大鼠(由动物实验中心购买)，全部大鼠饲养在22～25℃恒温动物房内，予以足够水及颗粒饲料，进行黑暗与光照处理(间隔12 h交替1次)；10只正常大鼠周龄5～10 w，平均(7.56±0.67)w；体重0.15～0.26 kg，平均(0.19±0.02)kg。20只先天性心脏病大鼠周龄5～11 w，平均(7.58±0.65)w；体重0.12～0.26 kg，平均(0.18±0.02)kg。

1.2主要药品与试剂 同型半胖氨酸购自北京博奥派克生物科技有限公司；水合氯醛购自四川佰春科技有限责任公司；野百合碱购自上海研生实业有限公司，货号：YS-R63643；生理盐水购自北京百奥莱博科技有限公司，货号：PY08-074；戊巴比妥钠购自湖北鸿运隆生物科技有限公司；酶联免疫吸附试验试剂盒购自上海沪震实业有限公司。

1.3主要仪器与设 八导生理记录仪购自北京华睿宝科技有限公司(型号：BIOPAC MP150)；低速离心机购自济南欧莱博技术有限公司(型号：TD-4X)。

1.4先天性心脏病大鼠建模方法 于孕鼠妊娠第7天，注入高剂量同型半胖氨酸200 mg/(kg·d)，1次/d，直至孕第17天，停止1 d后，孕第19天再次注射1次，注意每次注射结束需保证回抽无液体；孕第20天，在水合氯醛麻醉下剖宫取胎；于体视镜下观察仔鼠心脏结构，可见房间隔缺损、室间隔缺损、大血管错位等即可判定为先天性心脏病。

1.5先天性心脏病大鼠PH建模方法 采用野百合碱建立20只先天性心脏病大鼠PH模型，将野百合碱以2∶8比例溶于生理盐水中，配置成1%溶液，取50 mg/kg溶液注入大鼠腹部，1次/d，共注射28 d。注射结束，用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，使其呈仰卧位，区分左侧颈总动脉与右侧颈静脉，将压力感受器连接在左侧颈总动脉，并经右侧颈静脉置入含有0.3%肝素生理盐水的PE50导管直至右心室，将八导生理记录仪与压力感受器相连接，经记录仪观察压力波形变化，判断导管是否进入右心室，稳定后测定肺平均动脉压；海平面静息状态下，肺动脉平均压≥25 mmHg即可判定为PH。

1.6血清HMGB1、BNP水平检测 空白对照组、先天性心脏病大鼠眼眶取血2 ml，用低速离心机以1 000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，采取血清用酶联免疫吸附试验测定血清HMGB1、BNP水平，检验流程严格按照试剂盒说明书进行。

1.7统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验、Logistic回归分析。

2 结 果

2.1空白对照组、先天性心脏病组血清HMGB1、BNP水平比较 先天性心脏病组血清HMGB1、BNP水平〔(10.43±2.03)μg/L、(166.26±12.35)pg/ml〕高于空白对照组〔(4.25±1.24)μg/L、(79.25±9.62)pg/ml〕，差异有统计学意义(t=8.796、15.436,均P<0.05〕。

2.2先天性心脏病大鼠PH建模情况 20例先天性心脏病大鼠中，有13例(65.0%)PH建模成功。大鼠研究期间均无病死及意外死亡。

2.3发生PH、未发生PH先天性心脏病大鼠血清HMGB1、BNP水平比较 发生PH先天性心脏病大鼠血清HMGB1、BNP水平〔(12.63±3.25)μg/L、(185.35±15.24)pg/ml〕高于未发生大鼠〔(6.35±2.10)μg/L、(130.81±14.22)pg/ml〕，差异有统计学意义(t=4.592、7.804,均P<0.001)。

2.4血清HMGB1、BNP水平与先天性心脏病大鼠发生PH的回归分析 将先天性心脏病大鼠PH发生情况作为因变量(1=发生，0=未发生)，将血清HMGB1、BNP作为自变量(均为连续变量)，经Logistic回归分析结果显示，血清HMGB1、BNP水平升高是先天性心脏病大鼠发生PH的风险因子(OR>1，P<0.05)。见表1。

表1 血清HMGB1、BNP水平与先天性心脏病大鼠 发生PH的回归分析

3 讨 论

先天性心脏病作为心脏外科常见疾病，多因胚胎时期心脏及大血管发育异常所导致，据报道，先天性心脏病发生率为0.4%～1.0%〔7〕。临床研究发现，先天性心脏病长期发展会导致肺动脉压进行性升高，引发PH，而PH发生后会进一步增加右心负荷，形成恶性循环，增加心力衰竭发生风险〔8〕。因此，明确可能与先天性心脏病发生PH有关指标及机制，可能对临床早期干预有重要意义。

HMGB1作为高度保守的蛋白质，其在细胞核内可与DNA、组蛋白相互作用，调节生物体内转录过程，在细胞核外可与趋化因子、病原相关分子相互作用，调控细胞因子表达〔9〕。研究显示，HMGB1可结合晚期糖基化终末产物、toll样受体2、4等受体，其中与toll样受体4结合后可活化核转录因子κB(NF)-κB，促使巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α、白细胞介素6等炎症因子，引发炎症反应〔10〕。而相关研究发现，NF-κB信号通路活化可能会导致肺动脉平滑肌细胞炎症性重构，导致肺动脉压升高〔11〕。另有研究发现，HMGB1在内皮细胞内可结合RAGE，损伤血管内皮细胞，促使血管病变〔12〕。近年来有研究发现，HMGB1是PH发生的起始因子，通过促进多种炎症介质释放，可引发肺血管炎症反应，促进氧自由基释放，损伤血管内皮细胞，导致PH发生，而采用抗HMGB1抗体干预，可阻止PH发展〔13〕。BNP是由32个氨基酸组成的多肽，主要由心室分泌，可阻滞缩血管活性肽生成，促使血管平滑肌细胞松弛，抑制心肌纤维细胞增殖〔14〕。目前，BNP已被作为心力衰竭敏感标志物之一，心肌细胞受损后会大量分泌BNP入血，且BNP水平不受年龄、肾功能等因素影响，可良好反映心功能状态〔15〕。研究发现，BNP表达与急性肺栓塞患者PH发生有关，且BNP可作为PH发生评估指标之一〔16〕。结合HMGB1、BNP作用机制，推测二者与先天性心脏病大鼠发生PH有关。

本研究结果初步说明HMGB1、BNP可能与先天性心脏病有关。分析原因在于，先天性心脏病大鼠心脏负荷大会损伤血管内皮细胞，导致损伤分子HMGB1表达增加，且受损的心肌细胞会大量分泌BNP，从而导致血清BNP水平大幅升高〔17〕。本研究进一步证实HMGB1、BNP与先天性心脏病大鼠发生PH有关。分析原因，HMGB1水平升高会促使多种炎症因子生成，引发肺血管炎症反应，导致肺动脉血管重构，增加肺动脉压；BNP水平升高提示心肌损伤严重，可能会增加肺血流量，从而增加PH发生风险〔18〕。但本研究并未分析HMGB1、BNP预测先天性心脏病大鼠发生PH风险价值，研究结果存有局限，未来仍需展开前瞻性研究加以验证，并将所得结果在先天性心脏病患者中推广应用。

综上，先天性心脏病大鼠发生PH与血清HMGB1、BNP水平升高有关，考虑未来可检测血清HMGB1、BNP水平，辅助评估先天性心脏病并发PH的风险。