miR-539靶向GPD1L对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型凋亡和自噬的影响

周杰 李敬东 权刚 孙骥

(川北医学院附属医院肝胆一科，四川 南充 637000)

急性胰腺炎(AP)是一种常见的胃肠道疾病，其发病率不断上升，且死亡率较高〔1〕。研究表明，在AP细胞系和动物模型中会出现miRNA的差异表达，与胰腺腺泡细胞凋亡和自噬及炎症进展有关，减少自噬相关蛋白胞浆型LC3(LC3-Ⅰ)向膜型LC3(LC3-Ⅱ)转化，并抑制 Beclin1的表达〔2～5〕。miR-539在AP模型中高表达〔6〕。miR-539可调节体内外线粒体分裂与凋亡〔7〕。甘油3-磷酸脱氢酶1样蛋白(GPD1L)在AP组织中较正常组织低表达(Genbank ID：D42047)〔8〕。但miR-539和GPD1L在AP腺泡细胞中的影响尚未可知。本实验以雨蛙素(Cerulein)诱导胰腺腺泡细胞AR42J产生的AP细胞损伤为模型，研究miR-539和GPD1L的表达水平对雨蛙素诱导的AP模型AR42J细胞凋亡和自噬的影响。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶、Cerulein购自美国Sigma-Aldrich公司；GPD1L抗体、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、LC3-Ⅰ抗体、LC3-Ⅱ抗体、Beclin1抗体、p62抗体购自Abcam公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α 、白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；总RNA提取试剂盒、实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)试剂盒、反转录(RT)-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；流式法Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；引物、GPD1L干扰剂(si-GPD1L)、GPD1L过表达载体(pcDNA-GPD1L)、miR-539 mimics(miR-216a-5p)、miR-539抑制剂(anti-miR-539)、阴性对照、GPD1L野生型(WT)和突变型(MUT)报告载体购自上海吉玛制药有限公司；双荧光素酶报告系统试剂盒购自美国Promega公司；二喹啉甲酸(BCA)定量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和AP模型建立〔3〕细胞传代：将胰腺腺泡细胞AR42J培养于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、 5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换培养液，每2～3天消化传代1次。AP模型建立：将对数生长期的AR42J细胞以1×106个/ml的浓度接种于6孔板中，培养24 h，细胞融合度达到80%，然后加入终浓度为15 nmol/L的雨蛙素，对照组加入等体积的培养液，分别在培养至0、4、8、12、24 h时收集细胞，进行实验确认建模培养时间。

1.2.2检测培养上清中淀粉酶(AMY)、IL-6和TNF -α水平 收集经15 nmol/L Cerulein培养至0、4、8、12、24 h的AR42J细胞，然后取上清，根据AMY检测试剂盒、IL-6和TNF -α ELISA试剂盒说明书操作，检测上清中AMY、IL-6和TNF -α水平。

1.2.3实时荧光定量PCR检测miR-539和GPD1L mRNA的表达 收集经Cerulein处理的对数生长期AR42J细胞，提取细胞总RNA，然后合成cDNA，以cDNA为模板，按照实时荧光定量PCR说明书进行反应，检测miR-539和GPD1L mRNA含量。miR-539 上游引物 5′-GGAGAAATTATCCTTGGTGTGT-3′，下游引物采用通用引物；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′；GPD1L上游引物5′-CGCTGGGAATCACCCTCATC-3′，下游引物5′-CATTACTTTGCTGCCGATGGT-3′；β-actin上游引物5′-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游引物5′-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3′。用2-ΔΔCt法进行数据分析，并以内参β-actin进行校正。

1.2.4细胞转染 收集培养至对数生长期的AR42J细胞，用培养液稀释至5×105个细胞/ml，以每孔200 μl细胞接种于6孔板中，培养24 h，进行转染。将anti-miR-con、anti-miR-539、miR-con、miR-539、pcDNA-NC、GPD1L、anti-miR-539+si-con和anti-miR-539+si-GPD1L等载体，转染入培养好的AR42J细胞中，分别以转染载体或片段命名组别，转染48 h，收集细胞，进行检测验证和AP细胞建模。

1.2.5流式细胞术测定细胞凋亡率 收集转染和(或)Cerulein处理后的各组AR42J细胞，胰酶消化，离心收集细胞，洗涤3次，按照流式法 Annexin V/PI 试剂盒说明书进行操作，加入500 μl缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC标记和5 μl碘化丙啶(PI)混匀，室温避光孵育20 min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.6Western印迹检测蛋白表达 收集各组AR42J细胞，破碎细胞并提取细胞蛋白，测定总蛋白浓度。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白转膜，室温封闭2 h，加入稀释的对应一抗，4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，然后加入稀释的二抗，室温孵育2 h，以β-actin为内参照，分析蛋白表达水平。

1.2.7双荧光素酶报告实验 根据1.2.4进行转染，将构建的GPD1L的野生型(WT)和突变型(MUT)报告载体，分别与miR-con或miR-539共转染AR42J细胞，转染48 h后，收集细胞，裂解细胞，离心收集上清，根据试剂盒说明书检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1Cerulein处理对AR42J细胞AMY、TNF-α和IL-6表达的影响 与0 h组相比，Cerulein处理4～24 h组AR42J细胞中AMY、TNF-α和IL-6含量显著上升(P<0.05)，8 h时上升至最高水平，12 h和24 h含量又逐渐降低，见表1。根据结果后续选择Cerulein处理AR42J细胞8 h。

表1 Cerulein处理AR42J细胞对AMY、TNF-α和 IL-6表达的影响

2.2Cerulein处理对AR42J细胞miR-539和GPD1L表达的影响 与Control组相比，Cerulein组AR42J细胞中miR-539含量显著升高(P<0.05)，GPD1L mRNA和GPD1L 蛋白含量显著降低(P<0.05)，见图1和表2。

图1 Cerulein处理对AR42J细胞GPDIL蛋白表达的影响

2.3敲减miR-539抑制Cerulein处理的AR42J细胞凋亡和自噬 与Control组相比，Cerulein组AR42J细胞中miR-539含量和细胞凋亡率、Bax、LC3-Ⅱ Beclin1均显著升高，Bcl-2、p62含量显著降低(P<0.05)；与Cerulein+anti-miR-con组相比，Cerulein+anti-miR-539组结果相反(P<0.05)，见图2、3、4和表3。说明敲减miR-539可抑制Cerulein诱导的AR42J细胞凋亡和自噬。

表2 Cerulein处理对AR42J细胞miR-539、GPD1L mRNA 和蛋白表达的影响

1～4：Control组、Cerulein组、Cerulein+anti-miR-con组、Cerulein+anti-miR-539组图2 敲减miR-539对Cerulein处理的AR42J细胞 自噬相关蛋白表达的影响

图3 敲减miR-539对Cerulein处理的AR42J 细胞凋亡率的影响

图4 敲减miR-539对Cerulein处理的AR42J细胞凋亡 相关蛋白表达的影响

表3 敲减miR-539对Cerulein处理的AR42J细胞凋亡率、凋亡及自噬相关蛋白表达的影响

2.4miR-539靶向负调控GPD1L 通过StarBase预测结果显示，GPD1L的3′UTR序列中含有与miR-539互补的位点，见图5。双荧光素酶报告系统结果如表4所示，与miR-con组相比，miR-539组野生型GPD1L(WT)的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)，而突变型GPD1L(MUT)的萤火虫荧光素酶相对活性无明显变化(P>0.05)。与miR-con组相比，过表达miR-539的Cerulein处理组细胞中GPD1L mRNA和蛋白含量均显著降低(P<0.05)；抑制miR-539组的Cerulein处理组细胞中GPD1L mRNA和蛋白含量均显著升高(P<0.05)，见图6和表5。说明miR-539靶向负调控GPD1L的表达。

2.5过表达GPD1L抑制Cerulein处理的AR42J细胞凋亡和自噬 与Cerulein+pcDNA-NC组相比，Cerulein+GPD1L组的AR42J细胞中GPD1L、Bcl-2、p62水平显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ和Beclin1含量均显著降低(P<0.05)，见图7、8、9、10和表6。说明过表达GPD1L可抑制Cerulein诱导的AR42J凋亡和自噬。

图5 GPD1L的序列中含有与miR-539互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶活性检测AR42J细胞中miR-539与 GPD1L的靶向关系

1～4：Cerulein+miR-con组、Cerulein+miR-539组、Cerulein+anti-miR-con组、Cerulein+anti-miR-539组图6 miR-539对GPD1L蛋白表达的影响

表5 miR-539对GPD1L蛋白表达的影响

1，2：Cerulein+pcDNA-NC组、Cerulein+GPD1L组，下图同图7 过表达GPD1L对Cerulein处理的AR42J细胞的 GPD1L蛋白表达的影响

1,2：Cerulein+pcDNA-NC组、Cerulein+GPD1L组图8 过表达GPD1L 抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞 自噬相关蛋白表达的影响

图9 过表达GPD1L对Cerulein处理的AR42J细胞 凋亡蛋白表达的影响

图10 过表达GPD1L对Cerulein处理的AR42J细胞的 凋亡率的影响

表6 过表达GPD1L对Cerulein处理的AR42J细胞的凋亡率、凋亡及自噬蛋白的影响

2.6沉默GPD1L表达逆转敲减miR-539对Cerulein处理的AR42J细胞凋亡和自噬的影响 与Cerulein+anti-miR-539+si-con组相比，Cerulein+anti-miR-539+si-GPD1L组AR42J细胞中GPD1L、Bcl-2、p62、细胞凋亡率均显著下降，LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ和Beclin1、Bax显著升高(P<0.05)，见图11、12、13、14和表7。说明沉默GPD1L逆转了敲减miR-539对Cerulein诱导的胰腺AR42J细胞凋亡和自噬的作用。

1，2：Cerulein+anti-miR-539+si-con组、Cerulein+anti-miR-539+si-GPD1L组，下图同图11 沉默GPD1L表达对敲减miR-539介导Cerulein 处理的AR42J细胞中GPD1L蛋白表达的影响

图12 沉默GPD1L表达对敲减miR-539介导Cerulein 处理的AR42J细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图13 抑制GPD1L表达对敲减miR-539介导雨蛙素 处理的AR42J细胞自噬相关蛋白表达的影响

图14 沉默GPD1L表达对敲减miR-539介导Cerulein 处理的AR42J细胞凋亡率的影响

表7 沉默GPD1L表达对敲减miR-539介导雨蛙素处理的AR42J细胞凋亡和自噬相关蛋白、凋亡率的影响

3 讨 论

AP发病率逐年上升，由此引起的高死亡率和相关并发症严重威胁人类健康〔9〕。腺泡细胞的凋亡、坏死、程序性凋亡、自噬和凋亡等影响患者病情转归，凋亡减轻炎症〔10〕，异常自噬则导致细胞损伤和炎症〔11，12〕。多种miRNA在AP中异常表达，参与细胞凋亡、炎症、自噬等多种生物过程，与AP的进展、诊断、治疗靶点等有关〔13〕。AP模型建立方式众多，Cerulein或Cerulein联合脂多糖(LPS)处理AR42J细胞的方式运用较多〔14〕，且易操作。miR-539与细胞损伤和凋亡有关。miR-539可靶向基质金属蛋白酶-9调节脑缺血再灌注损伤中血脑屏障的通透性〔15〕，靶向ROCK1减轻脓毒症诱导的急性肺损伤〔16〕。miR-539通过直接靶向胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)抑制胰腺导管腺癌细胞增殖、克隆形成和侵袭〔17〕，通过靶向TWIST1在胰腺癌中抑制肿瘤〔18〕。本文结果说明miR-539在AP的发展中起重要作用。在骨关节炎中，GPD1L可调节软骨细胞的增殖、凋亡和炎症〔19〕。GPD1L的缺失或突变导致炎症、糖尿病、癌症等多种疾病〔20，21〕。本文研究结果表明GPD1L在AP发展中具有重要作用，胰腺细胞AR42J中miR-539与GPD1L之间具有调控关系。本文阐述了在Cerulein诱导的AP模型AR42J细胞中，miR-539上调，GPD1L下调，miR-539可通过靶向GPD1L调控Cerulein诱导的AP AR42J细胞凋亡和自噬，提示miR-539是AP的潜在分子靶点。