木蝴蝶总黄酮调控PDCD5对H2O2诱导H9C2损伤的影响

解娜

(新乡医学院第三附属医院心内科，河南 新乡 453003)

冠状动脉硬化性心脏病是临床常见的疾病类型之一，由于血脂血糖代谢紊乱导致灌注血管内皮慢性损伤而形成脂质斑块从而导致缺血缺氧性心脏疾病的发生，目前临床主要采用介入或支架手术恢复血流再灌注，但易造成再灌注损伤〔1～4〕。但关于缺血再灌注损伤的病理生理机制尚未完全阐明。木蝴蝶具有清肺利咽、抗炎、抗氧化等作用〔5〕。程序性细胞死亡因子(PDCD)5属于促细胞凋亡基因，其在心肌细胞损伤等过程中发挥重要调控作用〔6〕。因此，本研究采用过氧化氢(H2O2)处理心肌细胞建立细胞损伤模型，探讨木蝴蝶总黄酮对H2O2诱导的心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响，探究其对PDCD5的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 木蝴蝶(成都曼思特生物科技有限公司)；大鼠心肌细胞H9C2(美国ATCC公司)；H2O2(国药集团化学试剂有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)；pcDNA3.1(北京科展生物科技有限公司)；甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)凋亡试剂盒(美国Sigma公司)；兔抗鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(PDCD)5抗体(美国Abam公司)；兔抗鼠谷半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase9抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(武汉艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组 木蝴蝶总黄酮提取〔7〕：精确称量木蝴蝶粉末100 g，置于70%乙醇内浸润30 min，应用超声提取5 min(温度6℃，200 W)，转移至回流装置内30 min，反复提取3次，收集提取液，应用旋转式蒸发器回收乙醇，减压浓缩(15 ml)，转移至蒸发皿内，经过冷冻及干燥后得到黄酮类化合物，黄酮类化合物重量为5.65 g，提取率为6.65%，含量为18.35%。将总黄酮溶解于DMSO(0.1%)溶液内，制备木蝴蝶总黄酮母液，调整溶液浓度为10 mg/ml。取对数生长期心肌细胞接种于96孔板，设置control组(加入空白DMEM培养基)、model组(加入含有浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)〔8〕、experiment1组(加入含有浓度为2 μg/ml的木蝴蝶总黄酮与浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)、experiment2组(加入含有浓度为4 μg/ml的木蝴蝶总黄酮与浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)、experiment3组(加入含有浓度为8 μg/ml的木蝴蝶总黄酮与浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)〔9〕。后续实验设置pcDNA3.1组(pcDNA3.1转染至心肌细胞，加入含有浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)、pcDNA3.1-PDCD5组(pcDNA3.1-PDCD5转染至心肌细胞，加入含有浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)、experiment3+pcDNA3.1组(pcDNA3.1转染至心肌细胞，加入含有浓度为8 μg/ml的木蝴蝶总黄酮与浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)、experiment3+pcDNA3.1-PDCD5组(pcDNA3.1-PDCD5转染至心肌细胞，加入含有浓度为8 μg/ml的木蝴蝶总黄酮与浓度为200 μmol/L H2O2的DMEM培养基处理24 h)。

1.2.2MTT检测细胞增殖 1×103个心肌细胞接种于96孔板，分别加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，室温孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，室温振荡孵育10 min，应用酶标仪检测波长为490 nm处的吸光度值(OD)。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组心肌细胞1×105个经3 000 r/min离心6 min后弃上清，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，弃上清，加入500 μl结合缓冲液重悬细胞，收集细胞沉淀，向细胞沉淀中依次加入5 μl膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)与5 μl碘化丙啶(PI)，室温振荡孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.4检测MDA含量及SOD、GSH-Px活性 收集各组细胞培养上清液，参照试剂盒说明书检测各组MDA含量及SOD、GSH-Px活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5Western印迹检测caspase3、caspase9、PDCD5蛋白表达 收集各组心肌细胞后加入500 μl RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜，封闭，加入caspase3(1∶1 000)、caspase9(1∶1 000)、PDCD5(1∶800)与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗稀释液(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗稀释液(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2的细胞活性的影响 与control组比较，model组心肌细胞活力显著降低(P<0.05)；与model组比较，experiment2组、experiment3组心肌细胞活力显著升高(P<0.05)，且experiment2组、experiment3组心肌细胞活力比较差异有统计学意义(P<0.05)，而experiment1组心肌细胞活力与model组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2细胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影响

2.2木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2凋亡及PDCD5表达的影响 与control组比较，model组心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平显著升高(P<0.05)；与model组比较，experiment2组、experiment3组心肌细胞凋亡率及caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平显著降低(P<0.05)，且experiment2组、experiment3组心肌细胞凋亡率与caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而experiment1组心肌细胞凋亡率、caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平与model组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1、图2。

2.3木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影响 与control组比较，model组MDA的活性显著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性显著降低(P<0.05)；与model组比较，experiment2组、experiment3组MDA的含量显著降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px的含量显著升高(P<0.05)，且experiment2组、experiment3组MDA含量及SOD、GSH-Px活性比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，而experiment1组MDA含量及SOD、GSH-Px活性与model组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

图1 木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2凋亡的影响

1～5：control组，model组，experiment1组，experiment2组，experiment3组图2 木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2 凋亡PDCD5、caspase3、caspase9蛋白表达的影响

2.4PDCD5对H2O2处理的H9C2的细胞活性及凋亡的影响 与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-PDC-D5组细胞活力显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率及caspase3、caspase9蛋白水平显著升高(P<0.05)，见图3、表2。

2.5PDCD5对H2O2处理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影响 与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-PDCD5组MDA的含量显著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性显著降低(P<0.05)，见表2。

2.6PDCD5能逆转木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2的细胞活性及凋亡的影响 与experiment3+pcDNA3.1组比较，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5组细胞活力显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，caspase3、caspase9蛋白水平显著升高(P<0.05)，见图4、表3。

图3 PDCD5对H2O2处理的H9C2凋亡(A)及PDCD5、caspase3、caspase9(B)蛋白表达的影响

表2 PDCD5对H2O2处理的H9C2的细胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影响

2.7PDCD5能逆转木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影响 与experiment3+pcDNA3.1组比较，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5组MDA的含量显著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)，见表3。

1～2：experiment3+pcDNA3.1组，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5组图4 PDCD5能逆转木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2凋亡(A)及PDCD5、caspase3、caspase9(B)蛋白表达

表3 PDCD5能逆转木蝴蝶总黄酮对H2O2处理的H9C2的细胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影响

3 讨 论

心血管疾病已成为威胁人类生命安全的重要疾病之一，其具有发病率高及死亡率高等特点，既往研究显示荭草花中的黄酮等有效成分可减轻H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤及抑制细胞凋亡；山楂有机酸中的黄酮类物质、有机酸等可抑制心肌细胞氧化应激反应；参芎葡萄糖注射液可抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激〔10～12〕。但木蝴蝶的黄酮类提取物对H2O2诱导H9C2损伤的分子机制尚未阐明。

木蝴蝶醇提取物可减轻心肌微血管内皮细胞氧化型低密度脂蛋白氧化损伤〔13〕。研究显示从中药中提取的黄酮类化合物具有抗氧化作用，其中木蝴蝶总黄酮具有极强的清除氧自由基能力，还可对抗氧化应激反应，其可能作为治疗心血管等疾病的药物〔14，15〕。本研究结果显示H2O2处理条件下，木蝴蝶总黄酮可促使心肌细胞活力显著升高，在一定程度上呈剂量依赖效应，提示木蝴蝶总黄酮可促进H2O2诱导的心肌细胞增殖。心血管疾病发生过程中心肌细胞凋亡率显著增加，caspase3、caspase9被激活后可诱导细胞凋亡〔16〕。本研究结果显示H2O2处理条件下，木蝴蝶总黄酮可减弱心肌细胞凋亡能力及抑制caspase3、caspase9表达。氧化自由基生成量增加时细胞膜中的饱和脂肪酸可发生脂质过氧化从而生成MDA，若MDA的含量升高可反映心肌细胞过氧化损伤程度，SOD属于抗氧化酶类，还可还原生成H2O2进而被GSH-Px催化还原生成水及氧气从而减轻过氧化损伤〔17〕。本研究结果显示H2O2处理条件下，木蝴蝶总黄酮可降低MDA的含量而增高SOD、GSH-Px活性。

PDCD5在心肌梗死等心血管系统疾病中表达上调，沉默PDCD5表达可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡及自噬从而保护心肌细胞〔18〕。沉默PDCD5表达可抑制肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的关节软骨细胞凋亡从而减轻细胞损伤〔19〕。抑制PDCD5的表达可抑制心肌细胞凋亡〔20〕。本研究结果显示H2O2处理后心肌细胞中PDCD5蛋白水平升高，而木蝴蝶总黄酮处理后心肌细胞中PDCD5蛋白水平降低，PDCD5过表达可抑制H2O2诱导的心肌细胞增殖及促进细胞凋亡，还可提高氧化应激水平进而降低木蝴蝶总黄酮对H2O2诱导的心肌细胞损伤的作用。提示木蝴蝶总黄酮可能通过下调PDCD5的表达从而减轻H2O2诱导的心肌细胞损伤。

综上，木蝴蝶总黄酮可促进H2O2诱导的心肌细胞增殖及抑制细胞凋亡，并可抑制心肌细胞氧化应激反应从而对心肌细胞发挥保护作用，其作用机制可能与抑制PDCD5的表达有关，可为木蝴蝶总黄酮在心血管疾病中的治疗提供实验基础。