亚微米磁铁矿强化反硝化群落解析及功能预测

□马 姝

一、引言

在用煤制焦炭、煤气净化和焦化产品回收的过程中，产生了大量高浓度的焦化废水，其来源广泛、组分复杂、毒性大，是典型的难降解有机废水。目前，以活性污泥为主体的生物处理法是应用最广泛且经济有效的处理技术，但焦化废水中喹啉、酚类等毒性有机物浓度较高，影响微生物活动，生物处理效果不理想。近年来，磁铁矿廉价易得、电磁性能优良，已被证实能促进微生物间的直接电子传递、微生物生长和相关酶的活性，是一种优异的生物强化介导材料。然而，磁铁矿在厌氧条件下会被部分微生物利用而还原溶出Fe2+，随出水流出，导致其介导效应不可持续。

基于此，本研究提出向连续微氧运行的活性污泥反应器中投加亚微米级(0.1～0.3μm)磁铁矿来强化处理焦化废水。反应器性能结果显示[1]，与对照组AS体系(R1)相比，Fe3O4/AS复合体系(R2)具有更好的脱氮除碳效果和更强的抗冲击负荷能力，但R1和R2体系在微生物群落上的组成差异及功能预测尚未可知。

近几年，第二代高通量测序技术(如Illumina Miseq)具有操作简单、成本低、结果准确等优点，受到广泛关注和应用[2～3]。然而，仅基于对16S扩增子分析所获得的信息相对有限，学者开始将分类单元操作与细菌基因组功能建立联系，因此产生了PICRUSt技术，已被广泛应用于土壤和食品微生物类群揭示和功能预测分析[4]。

为了探究R2更高的污染物去除效果是否与体系内微生物群落组成有关，即长时间的污染物驯化是否改变了体系微生物的群落组成，采集了反应器稳定运行时期R1和R2体系的污泥样品，利用Illumina Miseq高通量测序技术进行了微生物群落解析，并利用PICRUSt技术对微生物基因进行了功能预测，以期为亚微米磁铁矿强化反硝化脱氮除碳机理进行微生物层面的补充和完善。

二、实验材料与方法

(一)实验材料。样本收集：采集两个反应器内连续运行80天后的原始污泥样品10mL，样品编号为R1和R2。

(二)实验方法。委托上海美吉生物医药科技有限公司对两反应器内污泥进行16S rRNA基因序列的测定。

三、结果与分析

(一)Alpha多样性分析。经PCR和高通量测序后，R1和R2获得的有效测序条带分别为55498和51509，在97%的相似水平上将上述测序条带分别聚类到402和329个生物分类单元OTUs。对测序得到的序列进行随机抽样，以抽到的序列数与它们对应的物种数目或Alpha多样性指数，构建稀释性曲线，来表征样品的取样深度情况，结果如图1所示。随着序列数的增大，R1和R2的曲线趋于平坦，表明样本的测序量合理，更多的测序量只会产生少量新的物种。

图1 测序样本的稀释性曲线

Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，由一些量化的度量标准来表征[5～6]。样本中微生物物种的多样性和丰富度分别由Shannon、Simpson指数和Chao 1、Ace指数来表征，Shannon指数越大、Simpson指数越小，样本的多样性越大；Chao 1、Ace指数越大，样本的丰富度越高。由表1可知，加入磁铁矿的R2实验组在反应器运行80天后，活性污泥中微生物的多样性和丰富度均较空白组R1有所下降，可能是由于与污染物降解和脱氮有关的微生物的富集导致的。

表1 R1和R2中微生物的Alpha丰富度以及多样性指标

(二)群落组成分析。在门水平上，含量最高的四个门分别是Proteobacteria(R1体系43.2%，R2体系50.1%)，Bacteroidetes(27.8%，13.8%)，Chloroflexi(13.8%，18.3%)，WPS-2(0.3%，12.9%)。Proteobacteria(变形菌门)在R2体系中有一定程度的增长，相对丰度较R1提升了16%。Proteobacteria(变形菌门)是革兰氏阴性菌，在焦化废水中占主导地位，是能够光谱降解有机污染物并使生物脱氮的主要细菌群体，在多种焦化废水或受焦化废水污染的土壤中以较高的相对丰度被检测到[7～9]，且研究表明[10～11]导电材料的投加能显著提升其相对丰度。Chloroflexi(绿弯菌门)是生产乙酸和其他短链脂肪酸的重要细菌门类，在R2中其相对丰度增长了31%。值得注意的是，R2中WPS-2的相对丰度显著高于R1，几乎是R1的40倍。WPS-2门，类似于蓝藻，是在受多氯联苯污染的土壤中分离鉴定得到的，最近被提出为念珠菌，被认为可能具有以叶绿素为基础的缺氧光合作用的能力，其具体的作用和机理尚不明晰。

图2

图3 R1和R2中微生物门水平和属水平群落组成

(三)功能预测分析。COG的注释结果如图4所示，两个系统中除去9%的序列功能未知，其余91%的序列被注释到了22个小类的功能。与R1系统相比，R2系统中注释到各功能的氨基酸序列的比例变化除出3个占比很小的功能外，其余19个功能的氨基酸序列数均存在不同程度的增加，主要增加的功能大部分与代谢和运输有关，碳水化合物、氨基酸、核苷酸、无机离子、辅酶运输和代谢分别增加了27%、19%、16%、23%和17%。R2中亚微米磁铁矿的加入增强了体系内微生物对污染物的代谢与运输，丰富系统中的代谢路径和功能，有利于体系的脱氮除碳。

图4 COG功能分类

KEGG的注释结果如图5和图6所示，样本在level 2的水平上主要被注释到22个功能上，分别隶属于level 1的四个功能大类。与R1系统相比，在R2系统中注释到碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)，膜运输(Membrane transport)，能量代谢(Energy metabolism)，氨基酸代谢(Amino acid metabolism)，DNA复制和修复(Replication and repair)，外源物质生物降解和代谢(Xenobiotics biodegradation and metabolism)的功能比例有一定程度的增加，增加比例在11%～27%之间，这与COG的注释结果基本一致。

图5 KEGG在level 2水平的热图

图6 KEGG在level 3水平的热图

在level 3的水平上，选取了丰度值前55的功能进行了热图比较分析。R2中显著增加的功能有转运蛋白(Transporters)，ABC转运器(ABC transporters)，氮代谢(Nitrogen metabolism)，苯甲酸降解(Benzoate degradation)，双酚降解(Bisphenol degradation)，细胞色素P450对外源物质代谢(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)，增加的比例在16%～32%之间。其中，ABC转运器是ATP结合盒转运蛋白，是一种重要的转运系统，能使微生物以高亲和力主动地转运可溶性化合物，如糖类，氨基酸，细胞代谢产物等，促进物质的跨膜转运[16～18]。这表明添加了亚微米磁铁矿的R2体系具有更丰富的转运系统，保证细胞代谢的营养物质的运输。

四、结语

使用Illumina Miseq高通量测序技术对两个反应器的污泥样品进行微生物群落解析，结果发现，Proteobacteria(变形菌门)为优势菌门，在R2中有一定程度的富集，相对丰度较R1提高了16%。优势菌属为Proteobacteria(变形菌门)下的Denitratisoma，Caldimonas和Azoarcus，其在R2中的相对丰度分别是R1的1.9，1.8和138倍。COG和KEGG注释结果表明R2体系内微生物对污染物具有更强的代谢和运输功能和更丰富的代谢路径。综上，亚微米磁铁矿的加入导致R2体系内富集了与反硝化脱氮和芳香族有机物降解有关的优势菌属，从而有更好的脱氮除碳效果，以期为介导材料在强化生物处理方面提供一定的借鉴和支持。