熊去氧胆酸对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

尤梅桂 田 华 曾 云

1.厦门医学院基础医学部药理教研室，福建厦门 361023；2.机能与临床转化福建省高等学校重点实验室，福建厦门 361023

脑卒中是我国成年人致死、致残的首位病因，具有发病率、致残率、致死率和复发率高的性质[1]。最常见的脑卒中类型是急性缺血性脑卒中，占我国脑卒中的70%左右[2]。缺血性脑卒中已成为全球范围内的严重问题[3]。目前，缺血性脑卒中的主要治疗手段是溶栓治疗[4]，针对缺血性脑卒中引起的神经功能性损伤尚无有效的治疗手段，溶栓治疗的患者当血流再次灌注可能发生脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI），因此寻找安全有效的治疗药物具有重要意义。目前有许多相关药物主要包括肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1、烟酸、二硫氨基甲酸肽吡咯烷、二甲胺四环素、尿酸、他汀类及各种中成药等，其主要是抗炎、抗氧化、血管内皮保护、抑制基质金属蛋白酶活性及促进细胞外基质形成等，虽然这些措施有一定效果，但大部分仍在实验阶段或其疗效有待于进一步临床验证[5-7]。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是名贵中药熊胆中主要有效成分之一，具有抗氧化应激、抗炎、抗凋亡、降低钙离子溶度等作用，保护CIRI[8-12]。近年来，研究发现药物可能通过磷酸化激活PI3K/AKT 信号通路干预脑缺血再灌注后氧化应激、细胞凋亡、血管生成等生理病理过程[13-14]，但是UDCA 能否通过激活PI3K/AKT 信号通路对脑缺血大鼠发挥神经保护作用，目前尚不清楚。因此，本研究采用线栓法建立大鼠CIRI 模型，通过行为学评价，氧化应激指标检测，PI3K/AKT 信号通路蛋白测定，阐明其神经保护作用及其机制，为CIRI 寻找新的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD 雄性大鼠40 只，SPF 级，250～280 g，上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供，许可证号：SCXK（沪）2018-0006，合格证号：2018000602 1904，SPF 级室温环境下分笼饲养3 d。本研究经厦门医学院伦理委员会审批。

1.1.2 药品与试剂 熊去氧胆酸片（购自上海上药信谊药厂有限公司，批号：41200801）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC）（购自大连美仑生物技术有限公司，货号：J1016A）；BCA 试剂盒（批号：20210105）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号：20210105）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号：20210104）均购自南京建成生物工程研究所；兔单抗PI3K、兔单抗AKT、兔单抗p-AKT 购自Cell Singling 公司。

1.1.3 仪器 Multiskan 全波长酶联免疫检测仪（美国热电公司）；5804R 台式高速常压离心机（德国Eppendoff公司）；凝胶成像系统（ChenmidocMP：Bio RAD）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 40 只雄性SD 大鼠按随机数字表法分为假手术组、大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）组、UDCA 60 mg/kg 组、UDCA 120 mg/kg 组，每组10 只。UDCA 各剂量组预防性灌胃给药3 d，第4 天通过线栓法构建大鼠MCAO 模型，阻塞1.5 h 后实现再灌注。评分在1～3 分的大鼠判定造模成功，行下一步实验，UDCA 各剂量组继续给药5 d。假手术组与MCAO 组灌胃等量溶剂。

1.2.2 MCAO 模型制备 参照Longa 等[15]方法，于末次给药1.5 h 后，皮下10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉，大鼠仰卧固定于手术板上。碘伏消毒，沿颈部正中线偏左切一个小口，钝性分离颈前肌群，再分离出右侧颈总、颈内和颈外动脉。动脉夹夹住颈总动脉近心端，再结扎颈外动脉。在距颈总和颈内、外动脉分叉处5 mm处用眼科剪剪一个“V”型小口，将一根鱼线圆头一端从开口处缓慢插入颈内动脉，插入深度18～20 mm，直到前端有阻力无法进入，结扎固定鱼线，当动脉阻塞1.5 h 后缓慢拔出鱼线实现再灌注，缝合颈部皮肤。假手术组只分离血管，不插鱼线，其他操作步骤相同。

1.2.3 神经功能评分 待大鼠苏醒后，参照Longa 等[15]的评分标准，对大鼠神经功能缺损情况进行评分。无神经功能活动障碍记0 分；提尾时手术对侧前爪未完全伸展、内收、屈曲记1 分；大鼠行走时向手术对侧不停旋转记2 分；大鼠行走困难，向手术对侧倾倒记3 分；无法自主行走、严重意识障碍或陷入昏迷记4 分。评分在1～3 分的判定造模成功，行下一步实验。

1.2.4 脑梗死范围的测定 末次给药后，每组随机选3 只，断头取脑，置于-20℃冰箱，快速冷冻20 min 后，冰块上去掉小脑、绣球和脑干残余部分，其余部分用手术刀沿冠状面将大脑切成5～6 片，迅速将脑片置于2%TTC 染液中，37℃避光染色30 min，15 min 后翻面。取出置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h，染色后梗死组织呈苍白色，正常组织呈玫瑰色，拍照。采用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件测量梗死面积。大鼠脑梗死体积=全部脑片梗死面积之和×脑片厚度；大鼠脑梗死组织百分比=大鼠脑梗死体积/全部大脑体积×100%。

1.2.5 SOD、MDA 含量测定 取脑组织0.1 g 置于预冷的生理盐水冰浴下超声破碎制备成10%的脑匀浆。4000 r/min 离心10 min，取上清，按试剂盒说明书测定。

1.2.6 PI3K/AKT 相关蛋白测定 取0.25 g 海马组织加入裂解液充分匀浆，离心后取上清，用BCA 法测定蛋白浓度，取40 μl 样品，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移到PVDF 膜上，室温下脱脂奶粉封闭1 h，摇床上洗涤5 min，加入含一抗的孵育盒，4℃孵育过夜，用TBST 在摇床上充分洗涤3 次。将PVDF 膜移入含二抗孵育盒，室温摇床上孵育2 h，用TBST 充分将膜清洗3 次。按比例配制发光液，将其均匀滴在PVDF 膜上，暗视野下，将PVDF 膜放入凝胶成像仪曝光显影。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，检验方差齐性后，两组比较采用t 检验，多组比较采用单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

MCAO 组大鼠神经功能评分高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.01）。UDCA 60、120 mg/kg 组大鼠神经功能评分均低于MCAO 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，±s）

注 MCAO：大脑中动脉阻塞；UDCA：熊去氧胆酸。与假手术组比较，aP ＜0.01；与MCAO 组比较，bP ＜0.05

2.2 各组大鼠脑组织TTC 染色结果及脑梗死组织百分比比较

脑组织TTC 染色甲醛固定后，玫瑰红色部分表示非梗死区，苍白色部分表示脑梗死区。假手术组脑组织全部为玫瑰红色，未见梗死病灶；MCAO 组大鼠脑梗死区显示明显的苍白色梗死区。见图1。MCAO 组大鼠脑梗死组织百分比高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.01）；UDCA 60、120 mg/kg 组大鼠脑梗死组织百分比均低于MCAO 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠脑梗死组织百分比比较（%，±s）

表2 各组大鼠脑梗死组织百分比比较（%，±s）

注 与假手术组比较，aP ＜0.01；与MCAO 组比较，bP ＜0.05。MCAO：大脑中动脉阻塞；UDCA：熊去氧胆酸

2.3 各组大鼠SOD 及MDA 含量比较

MCAO 组SOD 含量低于假手术组，MDA 含量高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.01）；UDCA 60、120mg/kg 组SOD 含量均高于MCAO 组，UDCA120mg/kg组MDA 含量均低于MCAO 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠SOD 及MDA 含量比较（±s）

表3 各组大鼠SOD 及MDA 含量比较（±s）

注 MCAO：大脑中动脉阻塞；UDCA：熊去氧胆酸；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。与假手术组比较，aP ＜0.01；与MCAO 组比较，bP ＜0.05

2.4 各组大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表达比较

MCAO 组大鼠脑组织缺血侧海马中PI3K、p-AKT蛋白表达低于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；UDCA 60、120 mg/kg 组大鼠脑组织缺血侧海马中PI3K、p-AKT 蛋白表达高于MCAO 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2、表4。

图2 各组大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表达情况（n=3）

表4 各组大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠PI3K 及p-AKT 蛋白表达比较（±s）

注 与假手术组比较，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；与MCAO 组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。MCAO：大脑中动脉阻塞；UDCA：熊去氧胆酸

3 讨论

脑缺血再灌注时产生大量活性氧消耗机体大量抗氧化物质SOD，线粒体能量供应障碍、钙超载、凋亡因子激活等，进而产生大量MDA，引起氧化应激损伤、神经细胞凋亡及死亡[16-20]。本实验检测大鼠脑组织中SOD 及MDA 含量，结果显示UDCA 可以增强CIRI 大鼠SOD，降低MDA 含量，减轻氧自由基的破坏作用，保护脑神经细胞。

PI3K/AKT 信号通路是经典的抗凋亡和促存活的信号通路，在维持细胞活性、抑制细胞凋亡中发挥重要作用。大量实验研究表明PI3K/AKT 信号通路在CIRI 中可通过清除活性氧、调控能量产生、抑制凋亡、保护神经元细胞发挥重要作用[21-23]。CIRI 时p-PI3K和p-AKT/AKT 显著下降，PI3K/AKT 信号通路处于关闭状态，而药物干预后p-PI3K 和p-AKT/AKT 显著升高，通过发挥抗凋亡作用使CIRI 明显减轻[24-28]，因此PI3K/AKT 通路对于CIRI 治疗是一个很有希望的靶点。本研究中MCAO 组p-AKT 蛋白表达显著下降，脑梗死体积增加，神经功能损伤严重，而UDCA 60 mg/kg组、UDCA 120 mg/kg 组p-PI3K 蛋白表达较MCAO组显著升高，因此推测UDCA 可能激活PI3K/AKT 信号通路，缓解脑缺血再灌注对脑细胞造成的损伤。

综上，本研究结果提示UDCA 对CIRI 具有很好的保护作用，改善大鼠一般状况，降低脑梗死体积，减少神经功能损伤，促进抗氧化酶活性，抑制过氧化产物生成。其作用机制可能通过抗氧化应激损伤及磷酸化激活PI3K/AKT 信号通路，发挥对CIRI 的保护作用。