芪蓟肾康汤对AngⅡ诱导人肾小球系膜细胞增殖及STAT3、SOCS3表达的影响

郭建仪，吕静，张春辉，庄晓岩，张忠胜

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032)

IgA肾病(IgA nephropathy)是指以IgA为主的免疫复合物沉积在肾小球系膜区的肾小球疾病[1]。流行病学显示，在中国乃至世界，IgA肾病在原发性肾小球疾病中发病率始终高居首位，此病最终会发展成为终末期肾病[2]。目前，IgA肾病的具体发病原因尚不清楚，其临床治疗药物西医多选择糖皮质激素或者免疫抑制剂，但后期随着用药剂量的增加，极容易出现肝肾损害，诱发感染[3]。陈以平全国名老中医工作室通过对IgA肾病做回顾性分析，发现中医药单独或联合应用均可改善IgA肾病患者的肾功能减退，越早加入中医药治疗，越能延缓肾功能下降[4]。

芪蓟肾康汤是专利方，临床有效治疗IgA肾病30多年。JAK/STAT信号通路是信号转导的常用途径[5]，可能与IgA肾病存在联系。转录激活蛋白3(STAT3)能够激活通路并促进信号转导[6]，细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)作为负调节因子，则反向抑制[7]。因此，为研究芪蓟肾康汤治疗IgA肾病的分子机制，本实验观察芪蓟肾康汤低、中、高剂量组及替米沙坦组对AngⅡ诱导人肾小球系膜细胞(HMCs)影响，采用ELISA法检测血清中STAT3蛋白表达的情况,qPCR法检测SOCS3 mRNA 表达量，分析芪蓟肾康汤治疗IgA肾病作用机制及靶点。

1 材料

1.1 动物

40只健康雄性大鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司，批号：SCXK(辽)2015-0001，饲养在辽宁中医药大学SPF级动物实验中心。

1.2 细胞株

人肾小球系膜细胞株，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.3 中药材

芪蓟肾康汤(黄芪、丹参、牡丹皮、仙鹤草、重楼、白花蛇舌草、老头草、小蓟等8味中药)，由辽宁中医药大学附属医院药剂科提供；替米沙坦片(80 mg/片，上海勃林格殷翰药业有限公司)。

1.4 主要仪器及试剂

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ，Wako公司)；ROX plus(Takara公司)；小牛血清(FBS，GIBICO公司)；STAT3 ELISA试剂盒(AMEKO公司)；RPMI-1640培养液(HyClone公司)；PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司)；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)。

2 方法

2.1 细胞培养

将人肾小球系膜细胞培养2 d后，换成RPMI-1640培养液进行培养，接种到培养瓶中。在镜下观察细胞，等到细胞株覆盖瓶底80%，吸出原培养液，丢弃，用缓冲液轻轻冲洗培养瓶，加胰酶3 mL，放置在37 ℃、0.5% 浓度的CO2培养箱消化5 min。消化之后，从培养箱取细胞，显微镜观察，发现细胞完全脱离，终止消化，形成细胞悬液。在离心管中加细胞悬液15 mL，设置参数4 ℃、2 000 r/min，离心10 min，吸取上清，在细胞沉淀中加入完全培养液，备用。

2.2 血清制备

将40只大鼠随机分为正常组，替米沙坦组(6.25 mg·kg-1·d-1)，芪蓟肾康汤低、中、高剂量组(11.8、23.6、47.2 g·kg-1·d-1)。先适应性喂养3 d，3 d后连续药物灌胃5 d，1次/d。5 d之后，脱颈处死，解剖腹主动脉，采血并分离血清，置于-20 ℃冰箱备用。

2.3 指标检测

2.3.1 MTT法检测细胞增殖

将细胞悬液接种到96孔培养板，包括6组，正常组，模型组，替米沙坦组，芪蓟肾康汤组分低、中、高剂量组。先培养24 h，24 h后吸出原培养液，在每孔加RPMI-1640 培养液150 μL。24 h后，弃上清，再按照分组加200 μL芪蓟肾康汤或替米沙坦含药血清，放到CO2培养箱。48 h之后，加入MTT培养液，终止培养，检测OD值。

2.3.2 ELISA法检测48 h、72 h STAT3表达

根据预实验结果，选择在48 h、72 h 后取上清液，用ELISA试剂盒反应并检测OD值。

2.3.3 qPCR法检测48 h SOCS3表达

引物由 Primer-BLAST[8]设计，内参基因是人β-actin，所得Ct值利用2-△△CT公式[9]计算出SOCS3 mRNA的表达量，使用的引物序列及产物情况，见表1。

表1 引物序列及产物大小

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 细胞增殖结果

各组增殖情况见表2。模型组与正常组相比，有明显差异(P<0.01)，结合数值，模型组细胞增殖最为明显，证明造模成功。与模型组相比较，替米沙坦组、芪蓟肾康汤中剂量组和高剂量组结果差异有统计学意义(P<0.01)，芪蓟肾康汤高剂量组缓解细胞增殖效果最明显，芪蓟肾康汤高剂量组和中剂量组系膜细胞增殖情况都低于替米沙坦组。

表2 各组细胞增殖情况

3.2 芪蓟肾康汤对STAT3的蛋白表达影响

48 h，在AngⅡ的刺激下，与正常组相比，模型组的STAT3含量明显增高 (P<0.01)；与模型组相比，芪蓟肾康汤高、中、低剂量组及替米沙坦组均能降低STAT3的蛋白表达(P<0.01)，而且随着芪蓟肾康汤剂量增加，降低STAT3的效果越明显，中、低剂量组效果低于替米沙坦组，芪蓟肾康汤高剂量组明显高于替米沙坦组，作用最强(P<0.01)。72 h，与模型组相比，芪蓟肾康汤高、中、低剂量组及替米沙坦组均有效降低STAT3的蛋白表达。说明芪蓟肾康汤可以有效降低STAT3蛋白表达，见表3。

表3 各组48 h、72 h时STAT3含量

3.3 芪蓟肾康汤对SOCS3的mRNA表达影响

基因表达结果表明，模型组SOCS3的mRNA表达与正常组相比显著降低(P<0.01)。与模型组相比，替米沙坦组，芪蓟肾康汤低、中、高剂量组均可促进SOCS3 mRNA表达(P<0.01)。芪蓟肾康汤组随着剂量的增加，促进SOCS3 mRNA表达的效果越明显。芪蓟肾康汤中、低剂量组SOCS3 mRNA含量表达低于替米沙坦组，芪蓟肾康汤高剂量组与替米沙坦组SOCS3 mRNA表达量相近。说明芪蓟肾康汤能够促进SOCS3 mRNA的表达，抑制AngⅡ诱导下人肾小球系膜细胞的增殖状态，见表4。

表4 各组SOCS3含量比较

4 讨论

肾小球硬化是IgA肾病的重要病理特点[10]，会出现系膜细胞增殖及细胞外基质积聚，其中局灶节段性肾小球硬化可以作为IgA肾病早期预后的指标[11]。AngⅡ是公认致肾小球硬化的因子[12]，因此选择AngⅡ诱导HMCs增殖。替米沙坦是血管紧张素Ⅱ受体拮抗药，广泛用于临床肾病治疗，减轻肾脏纤维化[13-14]，因此选择替米沙坦作对比。

JAK/STAT信号通路参与细胞增殖过程，可以与其他信号通路相互影响。JAK/STAT包括JAK相关受体、JAK和转录因子STAT，其中STAT蛋白是重要的生物标志物。STAT家族包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等7种蛋白[15]。细胞因子与JAK受体结合后会激活JAK，而活化的JAK能使STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3形成二聚体，结合靶基因，调控基因表达[16]。活化的STAT可促进负性调节分子SOCS的表达，而SOCS3能阻断STAT3与受体的结合，抑制STAT3的活化[17]。因此，检测芪蓟肾康汤和替米沙坦含药血清对STAT3、SOCS3表达的影响，分析其可能的作用机制。

中医学通常将IgA肾病归于“尿血”“水肿”范畴。不同中医学家对其发病机制有不同见解。王耀献教授认为风邪为始发因素，与湿邪胶结致病，主张从风湿论治，以搜风祛湿为主[18]。刘光珍教授认为在IgA肾病不同分期，血瘀贯穿始终，治疗该以活血化瘀为主[19]。刘伟敬教授认为应从风、虚、瘀论治[20]。吾师认为虚、毒、瘀是致病之关键，因此从“补肾络、清肾络、消肾络”角度进行防治。芪蓟肾康汤正是以此法立方，包括黄芪、丹参、牡丹皮、仙鹤草、重楼、白花蛇舌草、老头草、小蓟等8味中药。

实验制备芪蓟肾康汤低、中、高剂量含药血清，作用于AngⅡ诱导的HMCs，检测STAT3、SOCS3表达情况，并与正常组、模型组、替米沙坦组对照。ELISA法检测STAT3蛋白含量，48 h时，STAT3模型组水平明显高于正常组，说明造模成功；芪蓟肾康汤组和替米沙坦组STAT3水平均明显下降，芪蓟肾康汤高剂量组STAT3含量最低，72 h结果与48 h基本相同。说明芪蓟肾康汤与替米沙坦均可通过降低STAT3表达抑制HMCs增殖，随着芪蓟肾康汤剂量的增加，效果越明显，高剂量组效果好于替米沙坦组。qPCR检测48 h时SOCS3 mRNA表达情况，SOCS3是负性调节因子，与正常组相比，模型组含量明显降低，说明造模成功；芪蓟肾康汤组与替米沙坦组均可提高SOCS3 mRNA水平，替米沙坦组含量最高，芪蓟肾康汤高剂量组含量也很高，且与替米沙坦组差异不具有统计学意义(P>0.05)。说明芪蓟肾康汤与替米沙坦均可通过促进SOCS3表达抑制HMCs增殖，随着芪蓟肾康汤剂量的增加，效果越好。

综上所述，芪蓟肾康汤可以通过正向降低STAT3表达，反向促进SOCS3表达，抑制HMCs增殖，缓解肾小球硬化。这可能是芪蓟肾康汤改善IgA肾病的分子机制之一。