醇化烟叶表面细菌筛选及增香效应研究

王 祯，刘 晨，王文婷，张 霞，朱先约，朱 萍，宋 凯

（甘肃烟草工业有限责任公司技术研发中心，兰州 730050）

0 引言

烟叶表面微生物数量庞大、种类繁多，在烟叶发酵过程中起到重要作用[1]。微生物存在于烟叶醇化的始终，对烟叶内在品质和外在色泽都起着十分重要的作用[2]。将有益微生物作用于烟叶表面，能够缩短醇化周期、增加烟叶香气、提升烟叶品质和提高烟叶安全性[3-5]。醇化烟叶表面微生物与烟叶的种质资源优良度、品种、产地、等级和醇化时间有关，品质优良、香气质量好的烟叶上含有的微生物种类和数量更加丰富。

目前，分离和鉴定烟叶表面微生物，筛选改善烟草品质和生物降解烟草有害物质的微生物资源是烟草行业的研究热点[6-8]。如Zhao等[9]利用泛菌株微生物降解类胡萝卜素生成香味物质。Ma等[10]利用放线菌产生香味物质香兰增加烟草香气。陈兴等[11]在烟叶上接种嗜热芽孢杆菌提升烟叶质量和香气。English等[12]从发酵烟叶上分离出嗜热细菌，将这些菌株用于烟叶发酵，促进烟叶的香气转化。张保国等[13]得到的克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)能产某种特定的酶类，具有一定脱氮作用。Ruan和Zhong等[14-15]利用分离到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)有效降低部分烟叶中的烟碱含量，处理烟叶得到的卷烟品质的香气质细腻柔和，劲头减小，刺激性和呛咳感减轻。已有报道芽孢杆菌、微球菌和嗜热菌等细菌能降低烟叶中蛋白质含量，改善烟叶品质[16-18]。目前对单一产酶和降解特性的微生物研究较多，而同时产多种酶的烟草增香微生物及其对烟叶品质改善作用的研究鲜有报道。

本研究以醇化库6个不同产地复烤后烟叶为原料进行微生物分离，经过产酶筛选和16S rDNA测序，将筛选出的菌株添入低等级烟叶进行人工醇化，研究增香菌株对烟叶品质的影响，旨在挖掘生物性烟草增香新技术，为优化烟叶醇化工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品 选取云南富源、福建三明、四川宁南、贵州桐梓、巴西和湖南永州6个产地的自然醇化片烟，由甘肃烟草工业有限责任公司片烟醇化库提供，采集时间为2019年。

1.1.2 供试烟叶 牡丹江X2F等级和庆阳B1K等级的醇化烟叶。

1.2 方法

1.2.1 样品表面细菌分离 采用常规平板稀释法[19]分离烟叶表面细菌。称取5 g烟叶样品，置于500 mL的三角瓶中，加入50 mL的生理盐水，210 r/min振荡45 min后收集滤液，在牛肉膏蛋白胨培养基[20]上37℃恒温培养24 h，挑取单菌落保藏备用。

1.2.2 产酶特性筛选试验 将分离的菌株分别点接于淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶筛选培养基[21-23]上，37℃培养24 h，菌种产酶能力大小根据“透明水解圈直径/菌落直径”来计算。

1.2.3 分离菌株的16S测序 16S引物序列(27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：TACGGYTA CCTTGTTACGACTT)。PCR扩增体系：17.8 μL H2O；3 μL Buffer；2 μL dNTP；正反向引物各3 μL，0.2 μL酶，1 μLDNA模板。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸 10 min。利用Illumina MiniSeq高通量测序平台对扩增后的PCR产物进行16S rDNA测序。

1.2.4 菌株增香发酵试验 取保藏菌种在牛肉膏蛋白胨培养基上37℃恒温活化48 h，接种到50 mL的LB液体培养基中，37℃、210r/min振荡培养18h，4℃、4000r/min离心15 min，收集的菌体用生理盐水反复洗涤后用无菌水重悬，菌体浓度稳定在3×108CFU/mL。将菌液均匀喷洒于100 g紫外灭菌的烟叶表面，对照为无菌水处理，将烟叶放置在烧杯中用灭菌纱布包裹，置于37℃、相对湿度60%的恒温恒湿箱中发酵10天。

1.2.5 烟叶感官品质评价 将烟叶样品卷制成单料烟样品[24]，由甘肃烟草工业有限责任公司技术中心有国家认证资质人员，依据YC/T 138—1998[25]对烟叶样品的香气质、香气量、余味、杂气、刺激性、燃烧性和灰色等7个方面进行感官评吸鉴定。

1.2.6 常规化学成分和多酚测定 依据烟草行业标准YC/T 159—2002、YC/T 468—2013 和 YC/T 161—2002[26-28]测定烟叶样品中总糖、还原糖、总植物碱和总氮含量。依据烟草行业标准YC/T 162—2011和YC/T 217—2007[29-30]测定烟叶样品中氯和钾含量。依据烟草行业标准YC/T 202—2006[31]测定烟叶样品中多酚类化合物绿原酸、莨菪亭和芸香苷的含量。

1.3 数据处理

利用SPSS Statistics 19软件和Microsoft Excel对数据进行处理和分析，运用Duncan’s新复极差法进行处理间差异的显著性检验，差异显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 烟叶表面微生物的分离和产酶分析

从6个烟叶样品中分离出112株细菌菌株。在分离培养的细菌中，经过产酶平板筛选（图1），得到产酶菌株84株。以水解圈大小作为产酶能力的评价指标，剔除生理生化鉴定重复的菌株，筛选出7株具有产酶优势的细菌并对其命名。7株细菌均产纤维素酶，其中 GY96、GY99细菌同时产 3种酶，GY51、GY53、GY67和GY85同时产纤维素酶和淀粉酶，GY72同时产纤维素酶和蛋白酶，如表1所示。

表1 7株分离细菌的产酶情况

图1 产酶菌株在3种筛选培养基上的水解圈效果

2.2 筛选菌株鉴定

将7株细菌提取全基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物利用Illumina MiniSeq高通量测序平台进行16S rDNA测序。GY51为肠杆菌属(Enterobacter sp.)细菌，GY53为泛菌属(Pantoea sp.)细菌，GY67为微球菌属(Micrococcus)细菌，GY72为假单胞菌属(Pseudomonas)细菌，GY85为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)细菌，GY96和GY99为芽孢杆菌属(Bacillussp.)细菌。

2.3 微生物醇化对烟叶感官品质的影响

将筛选菌株分别喷洒于牡丹江X2F和庆阳B1K的低等级烟叶醇化20天后，烟叶的香气量和协调性提高，舒适度提升，口感得到改善，杂气下降。这可能是增香菌株生长繁殖时产生的次级代谢产物通过生物酶的催化改变了烟叶的某些化学成分导致的，进而改善烟叶质量[32]。

如表2所示，不同菌株对烟叶感官质量影响存在一定差异性。在2种烟叶中，与对照相比，菌株GY99处理后的牡丹江和庆阳烟叶总分分别增加了2.26分和2.03分，其中牡丹江烟叶香气质、香气量、余味和杂气分别增加了0.44、0.44、0.32、0.28分，庆阳烟叶分别增加了0.33、0.33、0.32、0.24分；菌株GY96处理后的牡丹江和庆阳烟叶总分分别增加了1.92分和1.77分，其中牡丹江烟叶香气质、香气量、余味和杂气分别增加了0.36、0.54、0.23、0.26分，庆阳烟叶分别增加了 0.29、0.53、0.30、0.26分；GY99和GY96增加香气质和香气量，余味舒适，杂气较轻，刺激性改善。菌株GY67和GY72处理能够改善香气质、余味、杂气、刺激性和燃烧性，且GY72处理后余味改善明显，处理后的牡丹江和庆阳烟叶分别增加0.34、0.35分，但香气量与对照相比略有下降，2种烟叶均下降0.03分；GY51、GY53和GY85处理后香气质提升，处理后的牡丹江烟叶香气质分别增加了0.12、0.14、0.11分，庆阳烟叶分别增加0.24、0.17、0.16分，但香气量下降，且GY51处理后余味不舒适感和刺激性增加，GY53和GY85处理后杂气增加，余味改善不明显。综上所述，菌株GY99处理后的烟叶感官评吸各项得分均高于其他菌株处理样品，香气质和香气量均有增加，刺激性和杂气降低，舒适度提升，感官质量提升最为明显；其次是GY96、GY72、GY67处理样。

表2 烟叶感官评吸指标得分统计分析

2.4 微生物醇化后烟叶化学成分和多酚含量的变化

如表3所示，牡丹江烟叶中，与对照相比，烟丝化学成分中总糖、还原糖、总植物碱和总氮含量有明显变化，氯和钾含量变化不大。GY67处理的烟叶总糖和还原糖含量明显增加，分别增加了2.86%和2.21%；GY96和GY99处理的还原糖分别增加了0.74%和1.01%，总糖分别减少了0.81%和0.06%；GY99处理的植物碱和总氮略微增加，分别为0.06%和0.14%；GY53处理氯增加0.09%，GY67处理氯降低0.01；GY51处理的钾含量增加0.05%，GY99处理的则降低0.03%。庆阳烟叶样品中，化学中总糖、还原糖和总植物碱含量有明显变化，总氮、氯和钾含量变化不大。GY96、GY67、GY99处理的总糖分别增加2.24%、0.92%和0.37%，还原糖分别增加3.67%、0.58%和2.91%，GY51、GY72、GY85处理的总糖分别下降0.67%、1.34%和0.52%，还原糖分别下降0.33%、0.40%和0.48%，GY72处理的植物碱含量增加0.15，%GY53处的理植物碱降低0.08%。

表3 牡丹江和庆阳烟叶经不同菌株处理后化学成分指标的统计分析 %

如表4所示，在2种烟叶中3种多酚类化合物的含量有明显变化。牡丹江烟叶中，GY72处理后的绿原酸、莨菪亭、芸香苷分别增加1.47、0.20和1.35 mg/g，GY99处理后三者分别增加3.56、0.05和0.58 mg/g，GY67的三者分别增加1.01、0.08和1.33 mg/g，GY96处理后绿原酸增加0.64。庆阳烟叶中，GY99处理后的绿原酸和莨菪亭含量明显增加，分别为3.25和0.11 mg/g；GY72处理后的莨菪亭显著增加1.85 mg/g，GY67和GY96处理后绿原酸分别增加2.61和1.77 mg/g。

表4 牡丹江和庆阳烟叶经不同菌株处理后多酚化合物的统计分析 mg/g

3 结论

（1）6个不同产地烟叶中分离出112株细菌菌株，其中84个菌株具有产酶能力，大部分能够产淀粉酶和纤维素酶，少数菌株能够产蛋白酶。

（2）7株细菌均能产纤维素酶，其中GY96、GY99细菌同时产3种酶，GY51、GY53、GY67和GY85同时产纤维素酶和淀粉酶，GY72同时产纤维素酶和蛋白酶。处理烟叶后能降解淀粉、纤维素和蛋白质等大分子物质，产生香味物质，使得舒适度提升，香气质和香气量增加，刺激性和杂气降低，有效增加烟叶香气。

（3）该试验筛选出一株可同时产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株GY99。同时还筛选到3株可明显改善烟草品质的菌株，分别是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株GY96、假单胞菌属(Pseudomonas)菌株GY72和微球菌属(Micrococcus)菌株GY67。菌株GY99处理样的感官评吸质量提升最为明显，烟支吸味品质有所增加，能有效增加烟叶香气和甜感，其处理后的牡丹江和庆阳烟叶总分分别增加了2.26和2.03分，舒适度提升，香气质和香气量均有增加，2种烟叶的香气质和香气量分别增加0.44和0.33分，刺激性和杂气降低，其次是GY96、GY72、GY67处理样。

（4）16SrDNA测序得知，GY99和GY96为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌，GY72为假单胞菌属(Pseudomonas)细菌，GY67为微球菌属(Micrococcus)细菌。

4 讨论

在2种烟叶中，GY67、GY96和GY99处理的还原糖显著增加，这可能是微生物降解淀粉产生水溶性糖，进入糖代谢途径[33]，同时3种菌在生长繁殖过程中分泌胞外多糖类物质[34]，导致烟叶中还原糖含量增加。王颖等[35]研究表明，烟叶中水溶性糖的含量与评吸质量呈正相关，大部分水溶性糖的反应产物和衍生物具有优美的香气，这些香气成分能够协调烟草本身香气，增加香气浓度，从而有效改善烟叶质量。有研究表明，烟叶中的氮含量与植物碱是衡量烟草品质的重要指标之一，含氮化合物与烟叶的香气品质密切相关[36]，植物碱则与烟气感官品质密切相关[37]。这与本研究结果一致，GY99调节烟叶总氮和植物碱含量，同时显著提升感官评吸质量。

多酚类化合物是烟叶中重要的香气前体物，是衡量烟草品质的重要因素，与烟草制品的等级呈正相关[38]。绿原酸和芸香苷作为烤烟特征香气成分，可赋予烟气清香和烤香[39]。GY99、GY96、GY67和GY72能够显著提高供试烟叶多酚化合物含量，对提升烟叶品质有正向作用。

淀粉和纤维素作为烟叶中存在的结构复杂分子量大的糖类化合物，含量过高会使烟叶燃烧时产生粗糙呛咳的烟气，影响吸味品质。本研究所筛选出的GY99、GY96和GY67能同时产纤维素酶和淀粉酶，能够降解淀粉和纤维素等大分子物质，产生香味物质，使得舒适度提升，香气质和香气量增加，刺激性和杂气降低，有效增加烟叶香气。

醇化烟叶表面微生物资源具有较大的应用潜力。围绕烟草行业库存烟叶压力较大的现状，提高烟叶工业可用性一直是行业研究的重点和难点，如何利用烟叶微生物资源提高烟叶品质和使用价值，是行业面临的现实问题和持续健康发展的需要。本研究立足于筛选改善烟草品质的烟叶微生物，后期应进一步探索筛选菌株对提高烟叶工业可用性的途径，提高库存烟叶在卷烟产品中的使用比例，提高烟叶价值，贡献地方经济。