超高效液相色谱法测定祛瘀生新胶囊胶囊中人参皂苷Rg1、Rb1及Re①

邓松岳，蒋俊春，王伟丽

(商丘市食品药品检验检测中心，河南 商丘 476000)

祛瘀生新胶囊主要成分包括黄芪、丹参、党参、山药、土茯苓、当归、三棱、莪术、肉桂、白术，具有活血止痛，软坚散结的功效[1]，适用于多种原因引起的行走困难、屈伸活动受限、髋部肿胀、疼痛等功能障碍性疾病[2,3]。本研究以其中人参皂苷Rg1、Rb1及Re3种有效成分为含量测定指标，建立超高效液相色谱法测定祛瘀生新胶囊中人参皂苷含量，为该制剂的质量评价提供参考。

1 试药与仪器

1.1 试药

祛瘀生新胶囊(吉林龙鑫药业有限公司，批准文号：国药准字Z20026010，批号：20191001、20191002、20191015、20190822、20190826、20190828，规格0.4g/粒)；人参皂苷Rg1对照品批号110754-201920，纯度92.4%，人参皂苷Rb1对照品批号110703-201915，纯度91.2%，人参皂苷Re对照品批号110704-201912，纯度93.4%，均购买于中国食品药品鉴定研究院，阴性对照品由医院制剂室提供，乙腈为色谱纯，水为纯化水系统所制超纯水，其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

日本岛津公司生产的LC-20A型超高效液相色谱仪，广东固特超声有限公司生产的VGT-2120QTD型超声清洗仪，上海梅特勒-托利多仪器有限公司提供的Sartorius CPA 225D型电子分析天平(精度0.01mg)。

2 方法

2.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅡ型色谱柱(2.6μm，150mm×150mm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：甲醇，梯度洗脱：0～10min采用40%～95%流动相A洗脱，10～20min采用5%～40%流动相A洗脱,20～22min采用5%流动相A洗脱。进样量5μL，流速0.25ml/min，柱温30℃，检验波长203nm。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品16.32mg、人参皂苷Rb1对照品16.68mg、人参皂苷Re对照品11.20mg，置于50mL容量瓶中，甲醇定容后摇匀，制成混合对照品溶液[4](人参皂苷Rg1浓度为199.88μg/mL、人参皂苷Rb1浓度为264.20μg/mL、人参皂苷Re浓度为141.52μg/mL)。

供试品溶液制备： 取待测样本，于研钵中研细，精密称定5g样品置于锥形瓶中，加入100mL甲醇，超声提取30min，冷却至室温后过滤，取75mL滤液蒸干，加30mL水溶解残渣，转移至分液漏斗，水饱和正丁醇提取20min，提3次，合并正丁醇萃取液，用40mL氨试液、40mL水饱和正丁醇洗涤2次，正丁醇夜蒸干，加甲醇溶解残渣，移至10ml容量瓶，甲醇定容后得到供试品溶液[5]。取阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备得到阴性对照品溶液。

2.3 方法考察

适用性试验[6]：分别取5μL混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，注入超高效液相色谱仪，结果显示，人参皂苷Rg1、Rb1、Re理论板数均大于3000，基线分离良好(分离度>1.5)。

线性关系考察：精密量取1μL混合对照品溶液进行测定，观察峰面积，得到人参皂苷Rg1、Rb1、Re线性回归方程，分析线性关系。

精密度试验：取混合对照品进样测定，纪录峰面积，根据人参皂苷Rg1、Rb1、Re峰面积的RSD判断

该方法精密度；稳定性试验：取不同时间(0、2、4、6、8、16h)的供试品溶液进行测定，纪录峰面积，根据峰面积的RSD判断供试品溶液稳定性；重复性试验：精密称取样品，制备6份供试品溶液，进样测定，纪录峰面积，根据峰面积的RSD判断该方法重复性[7]。加样回收试验：取6份已知含量样品，2.5g/份，分别加入人参皂苷Rg1、Rb1、Re对照品，制备供试品溶液进样测定，纪录峰面积，计算回收率。样品含量测定：取适量样品，精密称定后制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算样品含量。

3 结果

3.1 线性关系

人参皂苷Rg1、Rb1、Re线性回归方程分别为Y1=6.1765X1+49.831，Y2=4.5831X2+66.234，Y3=3.6498X3+80.236(r>0.9950)；结果显示，人参皂苷Rg1、Rb1、Re质量浓度分别在19.85～186.73μg/mL、25.39～261.40μg/mL、16.02～142.48μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。

3.2 人参皂苷Rg1、Rb1、Re回收率、精密度、重复性、稳定性

人参皂苷Rg1、Rb1、Re精密度在0.8%～1.3%，表明仪器精密度良好，稳定性在1.2%～1.6%，表明供试品溶液室温条件下稳定性良好，重复性在1.8%～2.1%，表明该方法重复性良好，三种成分回收率在96.10%～99.45%，符合要求。见表1。

表1 人参皂苷Rg1、Rb1、Re回收率、精密度、重复性、稳定性

3.3 样品含量

3种成分中人参皂苷Rb1含量最少，人参皂苷Re含量最多。见表2。

表2 样品含量测定结果(mg/g)

4 讨论

超高效液相色谱是将小颗粒填料应用在高效液相色谱法上，结合高灵敏度检测器和超高压输液泵发展而来的一种色谱技术，具有节约(流动相试剂消耗少)、环保、分离度高、效率高等优点，能够同时分析多种成分，且进样量少，灵敏度高，也适用于分析低组分含量[8]。祛瘀生新胶囊成分较复杂，人参皂苷为主要有效成分，采用超高效液相色谱法。

本研究中采用Shim-pack XR-ODSⅡ型色谱柱(2.6μm，150mm×150mm)，该色谱柱填料为高强度硅胶颗粒，对极性分子具有较强的反相保留能力，人参皂苷Rg1、Rb1、Re均为极性分子，能够获得较好的分离效果[9]。人参皂苷Rg1可快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用，人参皂苷Rb1具有增强胆碱系统的功能，增加乙酰胆碱的合成和释放以及改善记忆力作用，人参皂苷Re能抑制中枢神经，促进DNA，RNA合成，有升高血浆皮质酮、扩张血管的作用[10]。故可将人参皂苷Rg1、Rb1、Re作为祛瘀生新胶囊质量控制的指标性成分。为去除祛瘀生新胶囊中的干扰成分，本研究采用回流提取和超声提取，优化供试品制备中样品超声提取时间、氨洗涤用量和次数、正丁醇提取用量和次数等步骤，使处理方法更加简便且结果准确。通过对数种洗脱系统进行预实验，最终选择0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动相，洗脱效果较理想。

综上，高效液相色谱法测定祛瘀生新胶囊胶囊中人参皂苷Rg1、Rb1及Re含量简便可靠，重复性、稳定性好，精密度高，可作为该制剂中人参皂苷检测方法。