白花丹参水提物对大鼠血管内皮损伤修复的促进作用

姜国伟 常 庆 孟拥军 梁冬雨 易清清

(1 上海健康医学院附属嘉定区中心医院药剂科，上海，201800； 2 上海健康医学院附属嘉定区中心医院中心实验室，上海，201800)

白花丹参(SalviaMiltiorrhizaBge)为唇形科鼠尾草本属植物，药用其根。白花丹参有效成分为脂溶性和水溶性两部分，后者主要为酚酸类，包括丹参素，原儿茶醛，丹参酸甲、乙、丙[1]。现代药理学研究表明丹参具有抑制动脉粥样硬化、减少心肌耗氧量、抗肝纤维化、抗消化性溃疡、抗菌消炎及抗肿瘤等作用[2]。白花丹参对心血管的作用为降低心肌耗氧量、缩小梗死面积、抗动脉粥样硬化，这些都和丹参对内皮细胞的保护有关[3-6]。同时白花丹参可通过减弱缺氧时血管平滑肌细胞的收缩起保护作用[7]。因此，白花丹参的促进内皮细胞等细胞生长的作用引起了人们的注意[8]。故本研究探讨其水提物对损伤后大鼠血管内皮修复的促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar雄性大鼠，购自南京君科生物工程有限公司(许可证号：J002)，共60只，体质量250～280 g。动物饲养于上海嘉定先进技术创新与育成中心的无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级动物实验室，温度为25 ℃，湿度为65%。动物实验由上海市嘉定区中心医院伦理审查委员会批准(伦理审批号：2020-GZR-16-33028219803169204)。

1.1.2 药物 白花丹参由山东莱芜苗山中药产业化科技示范基地提供。采收时间为2018年10月。

1.1.3 试剂与仪器 盐酸肾上腺素(批号：329-63-5)购于天津金耀氨基酸有限公司，大鼠血管性血友病因子(von WillebrandFactor，vWF)酶联检测试剂盒(批号：PV977)、大鼠血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)检测试剂盒(批号：PV960)、大鼠单核细胞趋化蛋白(Monocyte Chemoattractant Protein，MCP-1)检测试剂盒(批号：PC128)和大鼠白细胞介素-10(Interleukin，IL-10)试剂盒(批号：PI525)均购于上海碧云天生物技术有限公司。eppendorf离心机(Eppendorf公司，德国，型号:eppendorf 5424/5424R)，Leica切片机(Leica Biosystems，德国，型号：RM2235)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 分组：60只大鼠均适应性喂养7 d，禁食12 h，自由饮水。随机选出15只作为空白对照组，标准饲料喂养。余45只均制作血管内皮损伤模型。将模型大鼠分成3组，每组15只，其中1组灌胃生理盐水作为模型组，另2组分别灌胃不同浓度白花丹参水提物作为低剂量给药组和高剂量给药组。

白花丹参水提物制备：将白花丹参根洗净自然晒干，切片后取适量置于煎煮容器内，入相当于药材量5倍的冷蒸馏水浸泡2 h，强火煮沸后，再以文火煎煮30 min，过滤；药渣加4倍量蒸馏水继续煎煮，煮沸后改文火再煎煮20 min，过滤。合并2次滤液，经滤纸过滤后喷雾干燥，得到白花丹参水提取物，4 ℃冰箱储存。临用时以蒸馏水配成1 g/mL和2 g/mL浓度[9]。

盐酸肾上腺素溶液配制：用生理盐水将1 mg/mL的盐酸肾上腺素稀释1.5倍，配成0.67 mg/mL溶液[10]。

血管内皮损伤模型制备：用上述0.67 mg/mL的盐酸肾上腺素，每天的8：00、12：00、16：00于大鼠腹部相同的部位皮下注射33.3 μg(0.05 mL)/100 g，连续注射5 d[10]。5 d后，将大鼠处死，开胸，分离大鼠胸主动脉，放入4%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色，显微镜下观察胸主动脉血管内皮损伤情况，进而判断是否造模成功。

1.2.2 给药方法 30只模型给药组在模型建立的第1天开始给药，低剂量给药组每只大鼠每天给1 g/mL丹参水提物1.5 mL，高剂量给药组每只大鼠每天给2 g/mL丹参水提物1.5 mL，连续灌胃给药17 d，其他对照组大鼠每天给予等量的水。

1.2.3 检测指标与方法 在模型建立后的第1、8、17天分别于各组中随机选择5只大鼠进行尾静脉取血约1 mL，血样于室温放置2 h后以4 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心10 min，取上清液备用。

vWF、VEGF、MCP-1和IL-10检测：分别按vWF、VEGF、MCP-1和IL-10检测试剂盒说明书步骤进行4种因子的检测。

各组大鼠胸主动脉血管HE染色：各组大鼠处死后，取胸主动脉，进行固定、包埋、切片和HE染色。于光学显微镜下观察各组大鼠胸主动脉血管内皮形态学的病理改变。HE染色方法：1)切片脱蜡，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min。2)100%(Ⅰ、Ⅱ)、90%、80%、70%乙醇各5 min，自来水冲洗5 min×3次。3)苏木精染色5 min，流水冲洗。4)5%盐酸乙醇分化1 min，流水冲洗。5)温水反蓝。6)伊红染色1 min，流水冲洗。7)70%、80%、90%、100%乙醇各10 s，二甲苯1 min，在通风橱自然晾干。8)滴上中性树胶，封片。

2 结果

2.1 各组大鼠主动脉血管内皮形态学的病理改变 正常对照组见图1A，胸主动脉内皮结构连续，完整光滑，内膜无剥脱缺失。血管内膜形态基本正常，结构完整。模型对照组血管HE染色见图1B，在显微镜下观察，能够看到模型组胸主动脉内皮不光滑，内皮细胞局部剥脱缺失，内皮表面炎症细胞附着，中层平滑肌排列疏松紊乱，断裂增厚，提示造模成功。白花丹参水提物低、高剂量组分别见图1C，图1D，镜下见胸主动脉血管内皮轻度不光滑，内皮表面有少量炎症细胞附着，中层平滑肌排列轻度紊乱。

图1 各组大鼠主动脉血管内皮病理学改变(HE染色，×100)

2.2 各组大鼠血清vWF含量比较 模型建立后取血测定vWF，与正常对照组(25.13±3.70)U/mL比较，模型组在1、8和17 d的vWF含量分别为(34.59±8.75)U/mL、(51.56±2.22)U/mL、(53.36±11.13)U/mL，白花丹参水提物低剂量给药组分别为(31.88±4.77)、(47.30±7.96)U/mL、(45.18±5.41)U/mL，高剂量给药组分别为(30.76±5.07)U/mL、(42.83±8.06)U/mL、(939.11±8.81)U/mL。给药组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。白花丹参水提物给药组的vWF含量低于血管内皮损伤模型组。见图2。

图2 各组大鼠不同时间血清vWF含量比较(n=5)

2.3 各组大鼠血清VEGF含量比较 与正常对照组(926.87±285.96)pg/mL比较，模型组在1、8和17 d的VEGF含量分别为(1 350.83±234.63)pg/mL、(1 643.48±156.62)pg/mL、(1 763.67±198.59)pg/mL，白花丹参水提物低剂量给药组分别为(1 314.83±255.36)pg/mL、(1 540.33±87.37)pg/mL、(1 607.32±244.07)pg/mL，高剂量给药组分别为(1 256.83±198.13)pg/mL、(1 435.78±165.32)pg/mL、(1 517.82±204.50)pg/mL。白花丹参水提物给药组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。白花丹参水提物给药组的VEGF含量低于血管内皮损伤模型组。见图3。

图3 各组大鼠不同时间血清VEGF含量比较(n=5)

2.4 各组大鼠血清MCP-1含量比较 模型建立后取血测定MCP-1，与正常对照组(23.87±2.96)pg/mL比较，模型组在1、8和17 d的MCP-1含量分别为(30.76±3.62)pg/mL、(38.83±4.63)pg/mL、(34.67±3.59)pg/mL，白花丹参水提物低剂量给药组分别为(26.14±4.07)pg/mL、(32.83±1.36)pg/mL、(29.33±2.37)pg/mL，高剂量给药组分别为(24.94±3.02)pg/mL、(28.73±2.32)pg/mL、(26.13±2.15)pg/mL。给药组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。白花丹参水提物给药组的MCP-1含量低于血管内皮损伤模型组。见图4。

图4 各组大鼠不同时间血清MCP-1含量比较(n=5)

2.5 各组大鼠血清IL-10含量比较 模型建立后取血测定IL-10，与正常对照组(178.11±12.34)pg/mL比较，模型组在1、8和17 d的IL-10含量分别为(160.76±13.12)、(122.63±8.83)、(134.57±13.59)pg/mL，白花丹参水提物低剂量给药组分别为(167.10±14.27)、(140.58±9.36)、(153.87±12.07)pg/mL，高剂量给药组分别为(173.45±18.77)、(159.65±10.36)、(168.21±11.43)pg/mL。白花丹参水提物给药组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。白花丹参水提物给药组的IL-10含量高于血管内皮损伤模型组。见图5。

图5 各组大鼠不同时间血清IL-10含量比较(n=5)

3 讨论

vWF是来自血管内皮细胞和血小板α颗粒的大分子糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成并储存于其中的怀布尔-帕拉德小体(Weibel-Palade body)。当血管内皮细胞受刺激时，vWF合成和释放增加，与内皮细胞上的胶原受体或血小板膜糖蛋白GM-Ib结合，完成血小板黏附并诱发血小板聚集和释放反应，释放的活性物质从多个环节激动内源性凝血途径，进而加速血栓形成[11]。此外，vWF还可促进纤维蛋白原合成，使血液黏滞性增加有利于血栓形成。因此，vWF作为可用于判断血管内皮受损情况的公认指标，很好反映了血管内皮的损伤情况。本研究发现白花丹参水提物给药组的vWF含量低于血管内皮损伤模型组，说明其可促进盐酸肾上腺素造成的大鼠血管内皮损伤的修复。

VEGF是近年来发现的直接而特异作用于血管内皮细胞的高效促有丝分裂因子，在刺激新血管发生与生长及维持血管壁的完整性和通透性方面均有重要意义。在众多诱导血管生成的因子中，VEGF被认为是特异性作用于内皮细胞的最重要的血管生成因子。基本培养条件下，低浓度VEGF就可促进不同来源的血管内皮细胞增殖[12-13]，很好反映了血管内皮的损伤情况。研究表明VEGF的分泌与血清呈现一定的时间和浓度的依赖性。VEGF表达增高，则促内皮细胞的有丝分裂作用加强，内皮细胞分裂增殖加速；血清能提供细胞生长的营养，细胞生长良好和增殖加速，则VEGF表达量增加。本研究发现白花丹参水提物给药组的VEGF含量低于血管内皮损伤模型组，说明其可促进盐酸肾上腺素造成的大鼠血管内皮损伤的修复。

MCP-1可由单核/巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞分泌，是属于趋化因子CC亚家族的一员。MCP-1对单核细胞的趋化具有强烈的介导作用，可促使血液中的单核细胞附着在受损的内皮细胞，导致炎症细胞聚集。MCP-1由趋化因受体-2(Chemokine Receptor2,CCR-2)激活后可参与多种炎症过程[14]。本研究发现白花丹参水提物给药组的MCP-1含量低于血管内皮损伤模型组，说明其具有促进盐酸肾上腺素造成的大鼠血管内皮损伤修复作用。

IL-10是由Th2型T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和角质细胞等产生的细胞因子，可以抑制炎症介质的生成。IL-10能降低单核细胞的贴壁功能，下调细胞黏附分子和趋化因子的表达[15]。IL-10能抑制巨噬细胞的活性，对T淋巴细胞的黏附和分泌具有下调作用。同时能抑制中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等炎症细胞的游走、浸润、增殖及活化[16]。本研究发现白花丹参水提物给药组的IL-10含量高于血管内皮损伤模型组，说明其具有促进盐酸肾上腺素造成的大鼠血管内皮损伤修复作用。

本研究发现白花丹参水提物能够降低大鼠内皮损伤模型vWF、VEGF和MCP-1的含量，同时促进IL-10的分泌，进一步证实白花丹参水提物具有促进盐酸肾上腺素造成的大鼠血管内皮损伤修复作用。