消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应抑制作用研究

纪 薇，马 莉，唐 洁，陈红霞，甘贤兵

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院皮肤科，安徽 合肥 230031)

痤疮是一种常见的毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病。雄激素诱导皮脂腺异常分泌、毛囊皮脂腺导管角化异常、痤疮丙酸杆菌增殖、免疫炎症反应等多种因素均与痤疮发生相关[1]。而微生物感染一直被认为是导致痤疮发生的重要因素之一，其中痤疮丙酸杆菌在痤疮患者毛囊皮脂腺中占微生物数量的89%[2]，是导致痤疮的主要致病菌。痤疮丙酸杆菌的增殖及其诱导的免疫炎症反应参与痤疮的整个发生过程。痤疮丙酸杆菌可以在细胞因子的参与下促使细胞产生抗菌肽和金属蛋白酶，并促进座疮的发生[3]。因此，抑制痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应是治疗痤疮的关键环节。目前，临床上针对痤疮致病菌的外用治疗主要以抗生素为主，但其存在成本高、复发率高、不良反应大[4]等问题，而中医外治法则具有独到的优势。

中医认为，痤疮属于“粉刺”范畴，由于热郁，阳气盛，肺主皮毛，肺经积热，外感风邪，邪热蕴结，熏蒸于面部而发，即主要是湿热瘀毒所致[5]。笔者以清热解毒、祛瘀生肌、利湿泄热、活血化瘀为原则，经过多年临床经验积累总结配制的中药面膜在临床上应用疗效显著，临床观察表明其具有明显的抗炎作用[6]，但具体抗炎机制仍不清楚。本研究在原有面膜基础上进行简化，选取其中主要成分组成消炎祛痘方(其组成为丹参、连翘、牛蒡子、苦参、黄芩)，进一步观察消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)炎症反应的影响，以初步揭示其治疗痤疮的作用机制。

1 材料

1.1 细胞及菌株 THP-1细胞：中国科学研究院上海细胞库；痤疮丙酸杆菌标准株：合肥臻沃生物有限公司。

1.2 试药 消炎祛痘方(药物组成为丹参、连翘、牛蒡子、苦参、黄芩)：安徽中医药大学第一附属医院；BHI培养基、RPMI-1640培养基、96孔板、6孔板：上海胤曦生物技术有限公司；细胞计数试验盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(批号 DCM7122)：武汉艾美捷科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)试剂盒(批号 E-EL-H0109c)、白细胞介素-1α(interleukin-1 alpha，IL-1α)试剂盒(批号 E-EL-H0088c)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)ELISA试剂盒(批号 E-EL-H6008)：Elabscience Biotechnology Co.，Ltd；Trizol(批号 10296028)：Invitrogen Corporation。

1.3 仪器 荧光定量PCR仪(型号 StepOne Software)：美国Applied biosystems；CO2培养箱(型号 CCL-170B-8)：厦门精艺兴业科技公司；电热恒温水浴槽(型号 HWS-24)：上海一恒恒温设备厂；PVDF膜(0.22 μm，型号 ISEQ00010)：美国Millipore；电泳仪(型号 BG-subMIDI)：北京百晶生物技术有限公司。

2 方法

2.1 中药提取物制备 取消炎祛痘方(丹参、连翘、牛蒡子、苦参、黄芩等比例配比)20 g，加蒸馏水200 mL浸泡30 min后加热，保持微沸，煎煮45 min，过滤；药渣加3～5倍水，煎30 min过滤。合并2次药液，水浴浓缩至20 mL(相当于原药材1 g/mL)，即为待测中药水提液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2 痤疮丙酸杆菌复苏培养 将痤疮丙酸杆菌接种于BHI培养基，37 ℃无氧条件下培养至对数生长期，得菌悬液，然后在6 700 r/m、4 ℃下离心15 min，得培养物上清液和细菌沉淀物。细菌沉淀物用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤3次，然后悬浮在PBS中，置于80 ℃水浴中30 min以热灭活，制成痤疮丙酸杆菌灭活物，4 ℃保存备用[7]。

2.3 CCK-8检测细胞活力 THP-1细胞常规复苏培养，接种96孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为2.5×106/mL，分别加入不同浓度(100、50、25、12.5、6.25 μg/mL)的消炎祛痘方溶液，以不加入消炎祛痘方为空白对照组，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，采用CCK-8法检测细胞活力，于450 nm处测定OD值，测定3次取平均值。细胞存活率=检测组的OD值/空白对照组的OD值×100%[8]。

2.4 诱导炎症细胞 收集悬浮的THP-1细胞，经细胞计数后，将细胞密度用含脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的RPMI-1640培养基调整到106/mL，铺入24孔板，将培养的痤疮丙酸杆菌进行离心(1 000 r/min，5 min)，每次加入1 mL的PBS进行细菌纯化，重复3次，最后一次吸去废液，用无LPS的RPMI-1640培养基重悬，按100∶1的比例将细菌与THP-1细胞[8]加入24孔培养板中，诱导12 h，以不加痤疮丙酸杆菌作为空白对照组，光学显微镜下观察，并拍照。

2.5 ELISA法检测TNF-α、IL-1α、IL-8表达水平 根据CCK-8实验结果，消炎祛痘方加药组选择25、12.5 μg/mL两个浓度进行后续实验。实验分组为空白对照组(不加消炎祛痘方及痤疮丙酸杆菌)、模型组(只加入痤疮丙酸杆菌)、消炎祛痘方高剂量组(加25 μg/mL消炎祛痘方与痤疮丙酸杆菌)、消炎祛痘方低剂量组(加12.5 μg/mL消炎祛痘方与痤疮丙酸杆菌)。将诱导后的THP-1细胞接种于6孔板，调整细胞浓度为1×106/mL，将无细胞毒性的消炎祛痘方溶液培养24 h，采用ELISA试剂盒，按说明书检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1α和IL-8含量。

2.6 qRT-PCR检测Toll样受体2(Toll like receptor 2，TLR2)、核因子-κB p65(nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65)mRNA表达水平 Trizol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。TLR2正向引物：5′-GTTGGGGGCGTTCATCTCTC-3′；反向引物：5′-CCAGACTGCGTGGTACTTG-3′。NF-κB p65正向引物：5′-AGCCGCTACAGTGTTACTCC-3′；反向引物：5′-TCCCCTGGAACTCATCTGCTA-3′。GAPDH正向引物：5′-CTGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；反向引物：5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。GAPDH为内参，比较循环阈值法分析基因相对含量。

2.7 Westen blot法检测TLR2、NF-κB p65蛋白表达水平 诱导后的THP-1细胞接种于6孔板，调整细胞浓度为1×106/mL，用无细胞毒性的消炎祛痘方溶液培养24 h，裂解细胞后提取蛋白，蛋白电泳后按常规方法转移至PVDF膜上，分别加入抗TLR2、NF-κB p65及β-actin抗体。4 ℃孵育过夜后，经HRP标记的二抗室温孵育1 h，按ECL试剂盒说明书进行曝光、显色。

3 结果

3.1 消炎祛痘方对THP-1细胞活力的影响 0、6.25、12.5、25、50、100 μg/L消炎祛痘方作用后THP-1细胞存活率分别为100%、98.87%、94.35%、81.85%、78.03%、62.25%。结果显示，消炎祛痘方在25 μg/mL范围内没有明显的细胞毒性作用(THP-1存活率>80%)，因此，选择25、12.5 μg/mL两个浓度梯度进行后续实验。

3.2 痤疮丙酸杆菌诱导THP-1细胞炎症反应 痤疮丙酸杆菌与THP-1细胞共培养前，THP-1细胞呈悬浮状，细胞圆润，折光率好(图1A)；痤疮丙酸杆菌与THP-1细胞共培养后，细胞干瘪皱缩，丧失原来形态(图1B)。结果提示，痤疮丙酸杆菌对THP-1细胞的形态产生一定的影响。

注：A.正常THP-1细胞形态；B.痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞形态图1 光学显微镜下观察THP-1细胞及痤疮丙酸杆菌诱导的炎症细胞(10×10倍)

3.3 消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞中TNF-α、IL-1α和IL-8表达水平的影响 与空白对照组比较，模型组THP-1细胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，消炎祛痘方高、低剂量组THP-1细胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表达水平均显著降低(P<0.05)；消炎祛痘方高剂量组THP-1细胞中TNF-α、IL-1α、IL-8水平显著低于低剂量组(P<0.05)。见图2。

注：A.空白对照组；B.模型组；C.消炎祛痘方高剂量组；D.消炎祛痘方低剂量组；与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与消炎祛痘方低剂量组比较，△P<0.05图2 各组THP-1细胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表达水平比较

3.4 消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表达水平的影响 与空白对照组比较，模型组THP-1细胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，消炎祛痘方高、低剂量组THP-1细胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表达水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；消炎祛痘方高剂量组THP-1细胞中NF-κB p65 mRNA表达水平显著低于低剂量组(P<0.05)。见图3。

注：A.空白对照组；B.模型组；C.消炎祛痘方高剂量组；D.消炎祛痘方低剂量组；与空白对照组比较，*P<0.05；与消炎祛痘方低剂量组比较，△P<0.05图3 各组THP-1细胞中NF-κB p65、TLR2 mRNA表达水平比较

3.5 消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞中TLR2、NF-κB p65蛋白表达水平的影响 与空白对照组比较，模型组THP-1细胞中NF-κB p65、TLR2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，消炎祛痘方高、低剂量组THP-1细胞中NF-κB p65、TLR2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；高剂量消炎祛痘方组THP-1细胞中NF-κB p65蛋白表达水平显著低于低剂量组(P<0.05)。见图4。

注：A.空白对照组；B.模型组；C.消炎祛痘方高剂量组；D.消炎祛痘方低剂量组；与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与消炎祛痘方低剂量组比较，△P<0.05图4 各组THP-1细胞中TLR2、NF-κB p65蛋白表达水平比较

4 讨论

痤疮病因复杂，多与雄激素水平升高、痤疮丙酸杆菌繁殖增多、皮脂腺分泌功能亢进、毛囊漏斗部异常角化等因素密切相关。皮脂分泌不通畅，形成角栓堵塞毛囊及皮脂腺导管，毛囊漏斗部角化增殖，同时，堵塞所造成的无氧环境也为微生物的繁殖提供了有利条件。中医认为，痤疮常由肺经风热阻于肌肤而发，即主要是湿热瘀毒所致。目前，有关中药治疗痤疮的抗炎作用研究多集中在单味药，如丹参具有抗氧化、抗炎，抑制皮脂腺活动[9]的作用；连翘具有降低毛细血管通透性，减少炎症渗出的作用；黄芩具有抗菌、抑制皮脂分泌[10]的作用；苦参、牛蒡子也可能在抗炎方面发挥较大作用。但痤疮的中医治疗应强调整体辨证论治，单方药的作用较为局限，无法达到整体的清热解毒、利湿泄热等功效，而消炎祛痘方从组方上来看，正是针对痤疮的中医病机辨证治疗，以达到清热解毒、祛瘀生肌、利湿泄热、活血化瘀的功效。如果能够从现代医学角度阐明其抗炎、抗角化作用的机制，将为外用中药复方在痤疮方面的治疗提供重要理论依据。

研究[11]表明，痤疮丙酸杆菌在痤疮患者样本中的检出率较高，痤疮丙酸杆菌被认为是主要致病菌。Dréno等[12]发现，痤疮丙酸杆菌感染皮肤时通过TLRs，尤其是TLR-2和TLR-4的表达激活先天免疫，产生IL-1、IL-8、IL-12等炎症因子，导致毛囊皮脂腺导管角化过度。汤红燕等[13]报道痤疮丙酸杆菌可刺激人外周单核细胞和巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-1、IL-8和TNF-α，上述细胞因子进而与表皮、毛囊和皮脂腺内相应受体结合，参与炎症反应。同时，NF-κB通路被认为是调节促炎因子的主要机制，是慢性炎症反应的重要因素。在痤疮的发生发展过程中，IL-1α起重要作用，能促进毛囊皮脂腺的角化，加重病情[14]。本研究发现，消炎祛痘方可有效抑制被痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞中炎症因子IL-8、IL-1α、TNF-α的分泌，因此，在抑制毛囊皮脂腺角化方面可能发挥一定作用，但具体机制还需进一步研究。同时本研究显示，消炎祛痘方能显著降低痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞内TLR2 mRNA表达水平，起到抑制炎症信号转导和继发性炎症递质生成的作用，并且能够抑制痤疮丙酸杆菌诱导的NF-κB p65表达，提示消炎祛痘方可能是通过TLR2相关信号通路来调控痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应。

本研究从消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞炎症因子的影响入手，初步证明消炎祛痘方能抑制痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应，但其对下游信号通路的影响还有待进一步研究。另外，对消炎祛痘方影响IL-1α引起毛囊皮脂腺角化方面的机制还需要进一步研究。