基于网络药理学研究“杜仲-续断”药对治疗膝关节炎的作用机制

许茂玉，盛炎炎，方 祥，周正新，李文华，朱 磊

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012； 2.安徽中医药大学第一附属医院骨科，安徽 合肥 230031)

膝关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种以软骨和软骨下骨退变、磨损及滑膜炎症为特征，以疼痛、畸形和功能障碍为临床表现的常见慢性筋骨疾病，严重影响患者的生活质量。KOA是使老年人致残的常见疾病之一，与性别、年龄、体质量指数、生物力学等因素有关[1]。该病好发于中老年人群，且女性多于男性。

中医学将KOA归属于“痹证”“骨痹”范畴[2]。中医药治疗KOA由来已久，早在《黄帝内经》就确立了“痹证”的基础理论体系。中医认为KOA因肝肾亏虚、筋脉瘀滞所致，总体治疗原则以补肝益肾、强筋健骨、活血化瘀为主[3]。中药治疗KOA具有疗效确切、安全性高的优势，对KOA的治疗具有很好的临床效应，在KOA的诊治中起到至关重要的作用。杜仲的主要功效为补肝肾、强筋骨、安胎，用于治疗肝肾不足、腰脊酸疼、足膝痿弱。现代药理学研究[4]表明，杜仲具有抗炎、抗氧化和促进骨愈合的作用。续断的主要功效是补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏，用于治疗肝肾不足、腰膝酸软、筋伤痹痛等。现代药理研究[5]显示，续断具有抗炎、促进骨愈合、平衡骨吸收与骨形成速率的作用。杜仲-续断配伍使用具有补肾壮骨、通痹止痛的作用[6]。但杜仲-续断配伍治疗KOA的作用机制尚不明确，因此有必要基于网络药理学方法进行探究。

网络药理学是药理学融合多学科方法而形成的一种新学科，能够全面地反映药物对疾病网络的分子作用机制[7]。本研究运用网络药理学和分子对接的方法，从杜仲、续断的化学物质基础出发，更加系统深入地挖掘杜仲-续断配对调治KOA的重要靶点和潜在的分子作用机制，以期更好地为治疗KOA的临床用药提供理论参考，同时为治疗KOA的新药研发提供新思路。

1 资料与方法

1.1 杜仲-续断相关靶点筛选 通过中药系统药理数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；https://tcmspw.com/tcmsp.php)[8]检索杜仲、续断的化学成分，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性指数(drug-likeness，DL)≥0.18[9]对活性成分进行初步筛选，以获取活性化合物，结合SwissTargetPrediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)查找药物作用的有效蛋白质靶点。

1.2 杜仲-续断活性的成分-靶点网络 筛选出蛋白质靶点后，利用Uniprot蛋白质数据库(http://www.uniprot.org)为化合物作用的蛋白质靶点信息进行标准化，使用Cytoscape3.8.0[10]构建杜仲-续断活性成分-靶点网络，其中“node”表示靶点，“edge”表示两者之间的关系。

1.3 KOA相关靶点筛选 通过检索OMIM数据库(http://www.omim.org)[11]、GeneCards数据库(http://genecards.org)[12]、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)[13]中KOA的潜在靶点，结合DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)挖掘治疗KOA的临床药物作用靶点[14]。合并4个疾病数据库靶点后，删除重复值得到KOA的靶点。

1.4 蛋白质交互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建 为明确杜仲-续断潜在靶点与KOA相关靶点之间的相互作用，运用Venny 2.1.0平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将杜仲-续断成分靶点与疾病靶点取交集，并绘制韦恩图。将共同靶点输入String 11.0数据库(http://string-db.org)构建PPI网络模型，选择蛋白种类为“Homo sapiens”，最小互相作用值设置为“medium confidence(0.400)”，隐藏网络中断开连接的节点，得到PPI网络。

1.5 杜仲-续断成分-KOA靶点功能与通路的富集分析 David平台(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)拥有一套全面的功能注释工具，以了解大量基因背后的生物学含义。将杜仲-续断配对调治KOA的共同靶点录入David平台，获取生物学过程和信号通路并进行富集分析，将获得的4个数据库资料根据count值选用TOP10、TOP20数据采用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制GO富集分析条形图、KEGG通路富集分析气泡图。

2 结果

2.1 杜仲-续断活性成分与靶点的获取 初步提取杜仲化学成分147种、续断化学成分31种，经ADME筛选和SwissTargetPrediction平台补充后共获得杜仲28种、续断7种有效活性成分，包括β-谷甾醇(beta-sitosterol)、槲皮素(quercetin)。杜仲有效成分作用靶点489个，续断有效成分作用靶点75个，合并后删除重复值共得到靶点243个。利用Cytoscape3.8.0对杜仲-续断活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制和分析，共获得279个节点与561条关系，节点的面积代表Degree值大小，面积越大说明该节点越重要，结果见图1。

注：三角形为药物有效活性成分，菱形为靶点，面积代表Degree值大小；DZ代表杜仲，XD代表续断；A为杜仲、续断共有活性成分图1 杜仲-续断活性成分-靶点网络图

2.2 KOA相关靶点的获取 从GeneCards数据库中共获得KOA潜在靶点2 070个，相关性得分(relevance score, RS)越高则代表该靶点与疾病联系更密切。本研究设定RS大于2倍中位数的目标靶点作为KOA的潜在靶点，在该数据库中KOA靶点RS的中位数为1.32，故设定RS>2.64的靶点为KOA的潜在靶点，共1 021个。结合OMIM、DrugBank、TTD数据库补充相关靶点，合并4个数据库相关靶点后删除重复值，最终得到1 072个KOA相关靶点。

2.3 PPI网络的构建 将筛选出来的药物有效活性成分靶点与KOA疾病靶点取交集，得到杜仲-续断药物成分-KOA共同靶点98个。进而将共同靶点输入String平台，得到杜仲-续断药对-KOA靶点的PPI网络，见图2。

图2 杜仲-续断药对-KOA靶点PPI网络图

2.4 靶点功能与通路的富集分析 应用David数据平台对上述获取的98个杜仲-续断药对调治KOA的关键节点进行信号通路分析，借助微生信平台对结果进行可视化。结果表明，多个靶点的功能与KOA的发生密切相关。杜仲-续断药对主要参与的生物学过程包括RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、药物反应(response to drug)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、转录的正调控DNA模板(positive regulation of transcription, DNA-templated)、炎症反应(inflammatory response)等，见图3中BP。在细胞组分中，主要作用于细胞外隙(extracellular space)、细胞核(nucleus)、细胞质(cytosol)、细胞质(cytoplasm)、胞外区(extracellular region)等，见图3中CC。相关靶点调节KOA的功能主要富集于蛋白结合(protein binding)、酶结合(enzyme binding)、相同的蛋白结合(identical protein binding)、蛋白质同二聚活动(protein homodimerization activity)、ATP结合(ATP binding)等，见图3中MF。将KEGG通路结果绘制成气泡图，气泡颜色从青到红代表Lg(P)值由小到大，气泡面积代表该通路的基因计数，横轴代表该通路基因富集数。KEGG富集通路显示杜仲-续断药对防治KOA的通路与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路等通路相关。见图4。

注：绿色代表生物过程(biological process，BP)，蓝色代表细胞组成(cellular component，CC)，红色代表分子功能(molecular function，MF)；Enrichment score代表富集基因数，数值越大代表BP、CC、MF越重要图3 杜仲-续断药对治疗KOA的作用靶点富集分析条形图

注：横坐标为该通路富集的基因数，气泡越大、颜色越红，代表富集程度越显著图4 杜仲-续断药对治疗KOA的KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

通过分析图1可以得出，β-谷甾醇、槲皮素等可能是杜仲-续断药对治疗KOA的核心有效成分。β-谷甾醇是植物甾醇类，属于四环三萜类化合物，具有抗炎、镇痛、抗氧化和调节骨代谢平衡的作用[15]。有研究发现β-谷甾醇能明显抑制TNF-ɑ、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)的水平起到抗炎作用，从而减轻关节炎的症状，同时还具有促进成骨和抑制破骨作用,达到骨保护的效果[16]。槲皮素是一种类黄酮化合物，存在于许多植物类药材中。现代药理学研究[17]表明，槲皮素具有抗炎、抗氧化的作用，通过降低TNF-ɑ、IL-6、CRP的含量从而具有治疗关节炎的作用，通过降低软骨变性和膝关节软骨细胞凋亡从而起到保护关节的作用。此外，槲皮素可以通过MAPK信号通路恢复成骨细胞功能，进而起到骨保护的作用[18]。KOA的临床疼痛症状多由局部炎症反应所致，杜仲-续断药对中活性物质β-谷甾醇、槲皮素在炎症反应中都具有独特的生物抗炎特性，符合KOA的治疗原则。

从本次PPI网络分析结果得到较为重要的靶点有MAPK1、TNF等。MAPK1属于MAPK家族成员，可被炎症因子激活，参与细胞增殖、分化的调节。有研究[19]表明，MAPK的高表达与软骨的降解密切相关，同时在保护关节被破坏方面具有极其重要的作用。TNF是由巨噬细胞分泌，能够激活细胞增殖，诱导细胞分化。病理研究[20]表明，在KOA的发病过程中，TNF是关键的炎症递质，密切参与调节炎症反应。同时有研究显示，TNF与KOA软骨变性相关，能够延缓软骨变性和KOA发展的作用[21]。可见，杜仲-续断药对可通过减轻炎症反应、调节细胞代谢和KOA靶点蛋白表达，从而缓解KOA的进程。

KOA发病首先侵犯关节软骨，参与关节软骨细胞增殖、分化的信号通路对于治疗KOA至关重要。KEGG通路富集分析结果显示，杜仲-续断药对治疗KOA涉及的信号通路有TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路。①TNF信号通路。Bonaventura等[22]研究发现，TNF信号通路参与炎症反应，调节软骨细胞、滑膜细胞的功能，从而促进血管增生、滑膜增殖。②PI3K-Akt信号通路。该通路属于调节自噬的经典通路，参与调节关节软骨细胞的平衡[23]，已被证实与血管修复再生、成骨细胞和破骨细胞分化密切相关[24]。相关研究[25]表明，PI3K-Akt信号通路在KOA患者中被抑制，该通路能够促进软骨细胞的自噬与凋亡，减少软骨细胞丢失率和减轻炎症反应，从而缓解KOA的症状。③MAPK信号通路。该通路属于骨关节炎软骨损伤的重要信号传导通路，能够影响成骨细胞的分化和凋亡[26]，同时有研究[27]证明该通路在改善KOA症状方面发挥重要作用。重要靶点富集出众多信号通路，可见杜仲-续断对于KOA的复杂调控过程，以上所讨论通路是重要靶点作用的主要通路，均与软骨细胞密切相关，可能在调控KOA的过程中起到关键作用。

综上，杜仲-续断药对调治KOA的主要成分可能是β-谷甾醇、槲皮素作用于MAPK1、TNF靶点，涉及的通路有TNF、PI3K-Akt、MAPK通路等，与炎症反应、自噬、血管生成、骨代谢等多个生物学过程息息相关。由此可知，杜仲、续断相须的配伍使用并不是简单的相同成分含量的增加，而是通过相关信号通路形成互补作用。本研究结果可为临床治疗KOA的用药提供一定的理论参考，同时能够为新药的研发提供新思路。