益生菌“量效关系”的科学综述

2022-08-17中国食品科学技术学会益生菌分会北京100048

中国食品学报 2022年7期

（中国食品科学技术学会益生菌分会北京 100048）

2001年，联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提出益生菌的定义：益生菌系指活的微生物，当摄取足够数量时，对宿主健康有益[1]。2020年，中国食品科学技术学会发布了《益生菌的科学共识（2020年版）》[2]，进一步明确了益生菌的3 个核心特征，即：足够数量、活菌状态及有益健康功能。同时提出：益生菌有益健康的功能属性是建立在科学严谨的临床试验评价和循证医学证据基础上的。临床研究发现益生菌对人体的健康作用存在一定的剂量-反应关系（Dose-response relationship）[3-5]。由于益生菌菌株健康作用具有菌株差异性，对于“足够数量”一词，标准法规中尚未有统一的表述，因此，探讨益生菌的摄入量与肠道健康之间的关系，对于益生菌产业的健康可持续发展至关重要。本文主要围绕益生菌摄入量与肠道健康作用的关系，首先整理了目前国内外益生菌的活菌精准计数的方法，其次综述了益生菌临床有效剂量与功能性便秘、腹泻及肠易激综合征等健康作用的关系及影响益生菌摄入量与肠道健康作用的因素，最后介绍了国际标准法规中对益生菌摄入量的建议等，在此基础上凝练形成六大科学观点，以期为我国益生菌的标准法规建设及产业化健康发展提供理论参考。

1 益生菌活菌精准计数

益生菌活菌的精准计数是评价益生菌量效关系的重要前提，也是我国市场监管益生菌相关产品货架期内菌种有效活菌数的重要依据。目前，国内外常见的乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌等的推荐标准计数方法（见表1），以平板计数【以菌落形成单位（Colony-forming units，CFU）计数】和流式细胞数（Flow cytometry，FCM）方法为主。对于单一菌株的益生菌产品，传统平板计数法通过对培养基的优化，能够相对准确地检测食品中菌种的属或种层级的活菌数，而对于多菌株混合的产品，平板计数法无法在菌株水平进行分别计数。在“第十六届益生菌与健康国际研讨会”上发布的“益生菌产品六大创新趋势”提出：多菌株益生菌及益生元复配提升益生菌的健康功能，逐渐成为益生菌产品的创新趋势，如乳杆菌、双歧杆菌等不同菌种/株的组合，亦或是益生菌与低聚果糖等益生元的复配，起到增加益生菌活菌数量或互补益生菌的健康作用。

表1 益生菌活菌计数的参考标准方法及适用范围Table 1 Standard methods for enumeration of viable probiotics

研究表明高通量测序技术、流式细胞技术、叠氮溴化丙啶（Propidium monoazide，PMA）与实时定量PCR （Quantitative real-time PCR，qPCR）等技术方法可实现菌株水平的活菌计数。PMAqPCR 活菌计数法已用于不同基质食物中益生菌的特异性定量，其基于膜完整性检测细胞活力，可有效区分活菌与死菌，且结果具有较高的准确性。Yang 等[17]建立的PMA-qPCR 方法用于乳杆菌活菌的定量检测，检测耗时仅为3 h，检测结果与平板计数法一致。Morovic 等[18]基于Illumina MiSeq平台的高通量测序技术对益生菌产品中混合菌株进行分类并量化其相对数量，然而该方法对益生菌菌株的种水平鉴定准确性不高。此外，流式细胞术也逐渐成为活菌计数的重要手段。Raymond 等[19]在以巧克力为基质的条件下，评估鼠李糖乳酪杆菌（Lactobacillus rhamnosus R0011）活菌计数的精确度和准确性，结果发现流式细胞术可确定产品中低水平的死亡细胞，而且益生菌粉末与食品基质的混合均匀程度并不影响活菌计数的精确度。

2 益生菌摄入量与肠道健康

益生菌一词在定义中要求“足够数量”，意味着益生菌的健康作用与摄入量有着密切的关系。临床研究表明（见表2），针对益生菌有效改善功能性便秘、腹泻和肠易激综合征等肠道健康问题，多数菌株的有效摄入量范围是107～1011CFU/d。

表2 部分益生菌与肠道健康作用的研究文献Table 2 Publications related to the effects of probiotics on gut health

（续表2）

2.1 益生菌与功能性便秘

便秘主要分为功能性便秘和器质性便秘两大类。器质性便秘是由脏器的器质性病变所致。功能性便秘主要与饮食类型、结肠蠕动、肠神经元和神经递质异常等因素有关。研究表明[4，22，43-44]，益生菌可通过调节肠道菌群，影响短链脂肪酸（SCFAs）和胆汁酸等肠道代谢物，进而刺激连接肠或迷走神经的黏膜受体直接作用于结肠平滑肌，或增加肠道内血清素（一种兴奋性神经递质）的浓度，或改变肠道内电解质和水的运输，通过肠道神经系统及内分泌系统影响肠道蠕动等方式，达到改善功能性便秘的作用。

一项荟萃分析表明[43]，补充益生菌动物双歧杆菌乳亚种HN019 和动物双歧杆菌乳亚种DN-173 010 有助于减少成人全肠转运时间，改善效果与益生菌菌株特异性有关。针对100 名有功能性胃肠道症状的患者（平均年龄44 岁，其中64 名女性，36 名男性）进行三盲、随机、安慰剂对照试验，结果发现，与安慰剂组相比，益生菌干预组摄入标志物的排泄时间显著缩短，表明益生菌具有改善肠蠕动，缓解便秘的作用[44]。摄入1.8×108CFU/d 的B.lactis HN019，能够显著缩短全肠转运时间，减少功能性胃肠道症状出现频率，在一定范围内增加益生菌剂量（1.72×109CFU/d），改善效果更明显。

Larsen 等[4]研究动物双歧杆菌乳亚种BB-12和副干酪乳酪杆菌CRL-341 混合菌株对健康年轻人（18～40 岁）粪便性状的影响，设置108，109，1010CFU/d 和1011CFU/d 4 个剂量组，持续干预3周，结果发现，摄入108CFU/d 的混合菌株能够降低受试者粪便性状，并随益生菌剂量的增加，受试者粪便硬度呈线性显著降低。此外，益生菌发酵乳也具有改善功能性便秘的功效，患者每日饮用含1.0×105CFU/mL 干酪乳酪杆菌 Zhang 和4.0×107CFU/mL 动物双歧杆菌乳亚种 V9 益生菌发酵乳200 g，通过调节胃肠道菌群和代谢途径，增加排便次数，显著改善患者便秘症状[22]。

2.2 益生菌与腹泻

腹泻一般是因使用抗生素和感染致病菌等因素引起。抗生素常用于治疗感染性疾病，然而，其副作用之一是破坏肠道菌群平衡，从而引起抗生素相关性腹泻（Antibiotic associated diarrhea，AAD）症状。研究表明[26，45-47]：益生菌可通过抵抗潜在致病菌预防感染，并增强先天性和适应性免疫系统功能；益生菌也可产生有机酸，促进肠道SCFAs 生成，或降低肠道pH 值和氧水平，为产SCFAs 的细菌提供更适宜的生存环境。此外，益生菌介导的肠道电解质转运体的改变可能也是预防腹泻的有效机制之一。

在1 项临床随机三盲对照试验[26]中，接受抗生素治疗的503 例成年住院患者被随机分配到安慰剂组、低剂量组和高剂量组，3 组患者每天分别服用剂量为0，4.17×109CFU 和1.70×1010CFU 4株益生菌组合制剂（嗜酸乳杆菌NCFM、副干酪乳酪杆菌Lpc-37、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07、动物双歧杆菌乳亚种Bl-04）。持续观察14 d 后，与对照组相比，摄入4.17×109CFU 益生菌组合制剂能够减轻患者的AAD 发病症状。此外，研究发现，嗜酸乳杆菌CL1285 和干酪乳酪杆菌LBC80R 混合株能够缓解成年住院患者AAD 症状[45]，与安慰剂相比，摄入5×1011CFU/d 混合株胶囊能够降低患者AAD 发病率，即使发病，患者症状持续时间较短。研究表明[46-47]益生菌在改善儿童腹泻和艰难梭菌感染方面也显示一定的作用。在针对艰难梭菌感染治疗的荟萃研究[47]表明，摄入剂量小于1010CFU/d 的鼠李糖乳酪杆菌GG、丁酸梭菌 588（Clostridium butyricum 588）和代田菌（Lacticaseibacillus casei Shirota）等特定益生菌，能够改善成人和儿童艰难梭菌感染。

2.3 益生菌与肠易激综合征

肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）作为一种多因素的胃肠道功能障碍，与肠道微生物紊乱、胃肠道通透性改变、低级别炎症、免疫反应失调等因素有关。益生菌可通过调节肠道菌群，产生抗菌物质和干扰肠黏膜黏附来调节胆汁酸代谢，促进肠道黏液分泌和肠上皮细胞连接结构关键蛋白的合成，增强上皮细胞的完整性，减少低度炎症和病原体数量，改善肠道内环境，维持肠屏障功能，调节先天性免疫和适应性免疫系统等方式，来缓解IBS 的临床症状。此外，益生菌还可能通过调节小肠中的免疫细胞群和肠道/黏膜相关的淋巴组织，通过刺激调节T 细胞来修复病原体引起的组织损伤，缓解IBS 的症状。

鼠李糖乳杆菌GG 已被证明能够有效干预儿童急性肠胃炎。研究发现，摄入鼠李糖乳杆菌GG 1010CFU/d 能够显著减少患者腹泻持续时间和住院时间，干预效果也随剂量增加呈上升趋势[48]。在一项针对362 名成年IBS 女性患者的试验发现，干预4 周后，摄入106CFU/d 长双歧杆菌婴儿亚种35624 能够显著改善IBS 综合症状评分，提高患者生活质量[37]。然而，另一项研究发现服用嗜酸乳杆菌NCFM 12 周后，109CFU/d 和1010CFU/d 两种剂量均可缓解患者中度至重度腹痛，且两组间无显著量效关系[49]。多菌株也被证明可用于缓解IBS 症状，与安慰剂相比，服用3×109～6×109CFU/d 的植物乳植杆菌CECT7484、植物乳植杆菌CECT7485 和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici CECT7483），能够显著增加IBS 患者生活质量评分，改善焦虑症状[50]。另一项复合益生菌干预IBS 患者的临床研究表明[42]，每日摄入1×1010CFU 的干酪乳酪杆菌Zhang、动物双歧杆菌乳亚种V9 和植物乳植杆菌P-8 复合益生菌可显著减少部分加重肠易激综合征的细菌，缓解IBS相关症状。

3 影响益生菌摄入量与肠道健康作用的因素

3.1 不同基质形式对益生菌健康作用的影响

益生菌通常作为原料或配料添加到食品基质中，形成不同配方的食品。益生菌在不同产品中的活菌数受环境条件（温度、pH 值、水分活度、氧气含量、氧化还原电势等）、食品基质、包装材料的影响。精准计数益生菌食品在临近货架期的活菌数量，是对益生菌功能评价的重要手段。

益生菌可与食品基质中的成分相互作用，从而影响益生菌活性和健康作用的发挥[51-52]。环境条件、基质成分等可能影响益生菌功能成分的含量，从而影响菌株的功能。例如，菌体分离或喷雾干燥过程可能会降低鼠李糖乳杆菌GG 的黏附能力[53-54]。乳品中的乳清蛋白、β-乳球蛋白可与鼠李糖乳杆菌GG 的菌毛pili 结合，可能影响菌株免疫调节功能的发挥[55-56]。一项荟萃分析发现，不同菌株和不同食用配方的益生菌在临床上均表现出缓解结肠袋炎、抗生素相关腹泻、艰难梭菌相关腹泻的症状，其中鼠李糖乳杆菌GG 或布拉迪氏酵母菌在不同食品基质中的健康作用效果稳定[57]。

基于目前的研究结果表明，益生菌在不同食品基质中的添加量存在差异，一般食品基质对益生菌健康作用的发挥没有实质性影响，不同食品基质中益生菌的有效作用剂量相对稳定[57-58]。

3.2 单菌株或多菌株对益生菌健康作用的影响

目前，多菌株复配益生菌的健康作用受到广泛关注。研究发现，多菌株的效果受到配伍菌种和目标人群等因素的影响。在针对幽门螺旋杆菌感染时，使用单一益生菌菌株或4 菌株混合物均未发现显著的改善效果，而双菌株混合物使其感染得以明显缓解[59]。针对某些生理异常（如肠易激综合症、抗生素相关性腹泻、特异反应性皮炎等），多菌株混合物并未体现出比单菌株更显著的效果[60]，然而，在一些疾病（比如小儿坏死性肠炎、幽门感染），益生菌组合干预具有更好的功效[61-62]。

研究表明多菌株发挥健康功效的原因可能是：

1）多菌种复合益生菌制剂可分解转化更多的营养物质（比如增加消化酶的多样性）和创造更好的微生态环境（厌氧、适宜pH），以更好维护人体肠道微生态多样性[61]。

2）菌种之间存在交叉互养行为，进而发挥了协同增效的作用[63]。普拉梭菌和青春双歧杆菌可协同增强丁酸盐的形成[64]。双歧杆菌和霍氏真杆菌的营养互作，可促进肠道中乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐和甲酸盐的形成[65]。同一菌属之间也存在潜在的肠道共生关系，由两歧双歧杆菌引发的黏蛋白交叉互养能够促进短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）的生长和代谢物积累[66]。

3）菌种复配丰富了其潜在的生理调节机制。与单一益生菌相比，瑞士乳杆菌和长双歧杆菌联合使用在调节糖皮质激素对HPA（下丘脑-垂体-肾上腺轴）轴的负反馈方面更有效，进而在缓解应激性内脏疼痛方面表现出更显著的效果[67]。益生菌组合相对于单一菌株，在缓解toll 样受体3（TLR3）相关炎症和维持细胞稳态方面具有协同作用[59]。基于VSL#3 微生态制剂的研究证明，多菌株复配可以增加各类目标菌株的肠道黏附性，进而促进菌株与宿主细胞的相互作用[68]。

总体来说，益生菌的健康调节作用并不存在明显的菌株复配数量依赖性，而是受到多种因素的复杂影响（例如：益生菌菌株、饮食模式的差异、目标人群特征、干预时间等）。无论是多菌株复配增效的益生菌组合，还是单一益生菌菌株，其健康作用效果主要取决于体外试验、循证医学证据等，而不仅仅是复配菌株的数量。

4 国内外标准、法规中对益生菌摄入量的要求

益生菌的健康作用与益生菌菌株、目标人群等多种因素有关。在标准法规或行业指南中很难统一规定益生菌的推荐摄入量。目前，国内外对于益生菌产品每日推荐摄入活菌数量的要求不尽相同。

国际上，益生菌的推荐摄入量主要在107～1011CFU/d。国际益生菌和益生元科学协会（Internatioal Scientific Associiation for Probiotics and Prebiotics，ISAPP）专家团队Binda 等[57]在益生菌应用指南中提出：目前多数研究提出益生菌的推荐量为108～1011CFU/d。2017年，世界胃肠病学组织益生菌与益生元指南（World Gastroenterology Organization Global Guidelineso Probiotics and Prebiotics）提出[69]：添加益生菌的产品所需剂量根据菌株和产品不同而有很大差异，在针对成年人或儿童的循证医学的证据中，大部分菌株的推荐摄入量是108～1011CFU/d，少数菌株推荐摄入量为106～107CFU/d。2018年，FAO/WHO 食品标准组联合国际食品法典委员会营养与特殊膳食食品委员会的讨论稿中指出：添加益生菌的食品推荐摄入活菌数要达到109CFU/d[70]。加拿大对于非特定益生菌菌株在食品中活菌数量的最低要求达到109CFU/份[71]，而作为医药配料的特定益生菌菌株建议摄入活菌总量不得少于107CFU/d[72]。2018年，意大利卫生部发布的《益生菌及益生元指南》[73]中提出，建议食用的益生菌产品应含有至少1 个菌株的活菌数达到109CFU/d，当有充分的科学依据支持所使用的菌种在肠道中具有定植能力，可以降低微生物的活菌数量。2020年，中华预防医学会微生态学分会发布的《中国微生态调节剂临床应用专家共识（2020 版）》指出，益生菌的作用具有菌株特异性和剂量依赖性，益生菌的补充剂量通常限制在108～1011CFU 的范围[74]。

5 小结与展望

综上所述，本文通过对益生菌摄入量与人体肠道健康作用研究现状的系统分析，经专家组多次讨论，形成以下六大科学观点：

1）益生菌的摄入量是其发挥健康作用的关键因素 “足够数量”是益生菌的三大核心特征之一，研究发现益生菌与对宿主的健康作用存在一定的剂量相关性。益生菌到达人体作用靶点，需要经过多个生物屏障，满足一定数量的活菌是其发挥健康作用的关键因素。益生菌相关产品中的活菌数量成为行业研发及创新过程重点关注的内容之一。

2）菌株水平活菌精准计数是度量益生菌剂量的重要技术条件在益生菌相关产品的标签上标示益生菌在保质期内的活菌数量，已成为行业共识。根据益生菌原料的稳定性状况与生产过程中菌株的实际添加量，可初步判断产品中益生菌菌株的活菌数。采用多技术联用的菌株水平活菌精准计数，是度量益生菌剂量的重要技术手段，也是我国市场监管益生菌相关产品保质期内活菌数是否符合要求的重要依据。

3）现有研究文献及国际相关标准法规对益生菌的推荐摄入量主要集中在107～1011CFU/d 益生菌的核心功能是改善人体肠道健康，其对肠道健康作用具有一定的剂量依赖性。益生菌应用指南、临床研究文献及国际相关标准法规中对益生菌的推荐摄入量主要集中在107～1011CFU/d。随着益生菌在多元化产品中的创新应用及下一代益生菌的出现，明确益生菌的推荐摄入量，有利于推动益生菌行业规范化发展。

4）益生菌的健康作用剂量具有菌株差异性，添加量并非越高越好由于益生菌功效的发挥具有菌株和人群特异性，每株益生菌的有效剂量具有差异性，有些菌株在较低剂量情况下也可以发挥健康作用，因此在益生菌菌株开发过程中应注重其生物学特性的研究，明确目标菌株在产品中的健康作用剂量，避免陷入益生菌添加量越高越好的误区。

5）益生菌在不同类型食品中的临床剂量相对稳定食品加工方式、基质成分、贮存方式的差异会在一定程度上影响益生菌的活性。对于含益生菌的食品，有必要在产品标签标示的贮存条件下评估菌株在货架期内的稳定性。益生菌在不同食品中的添加量存在差异。基于目前研究发现，一般食品基质对益生菌健康作用的发挥并没有实质性影响，益生菌在不同类型食品中的健康作用剂量相对稳定。

6）益生菌的健康作用不存在菌株复配数量依赖性，应以菌株间互作的科学研究为基础目前，益生菌多菌株复配的健康效应受到科技界和产业界的广泛关注。研究表明，多菌株复配的健康作用会受复配菌株和目标人群等因素的影响，并不存在明显的菌株复配数量依赖性。在益生菌菌株复配研究中须以菌株间互作的科学研究为基础，既要考虑菌株之间的交叉互养、协同增效的作用，还需充分考虑复配菌株之间是否存在竞争或拮抗关系。

顾问：

陈卫中国工程院院士、江南大学

邵薇中国食品科学技术学会

共同执笔人：

张国华山西大学

孙志宏内蒙古农业大学

翟齐啸江南大学

赵亮中国农业大学

夏永军上海理工大学

陈铮中国食品科学技术学会

罗江钊中国食品科学技术学会

项目组专家（按姓氏汉语笔画排序）：