依那西普对银屑病大鼠模型固有淋巴细胞亚群分型的影响

呼肖娜，李卫红

(1.杨凌示范区医院，陕西 杨凌 712100;2.西安市人民医院 西安市第四医院，陕西 西安 710004)

银屑病是一种非传染性慢性皮肤病，其特征是角质形成细胞过度快速增殖，是一种常见的T细胞介导的炎症性皮肤病[1]。它与主要攻击皮肤中的靶细胞，特别是角质形成细胞和黑素细胞的自身免疫反应有关，分别可导致细胞增生和炎症后色素沉着过度[2]。银屑病通常表现为皮肤上长期存在红色和尖锐的鳞状斑块，严重降低了患者的生活质量[3]。有研究[4]报道，银屑病通常会导致合并症的风险增加，例如炎症性关节炎、肥胖、高血压和炎症性肠病。人体免疫系统由两部分组成：先天免疫系统和适应性免疫系统。先天免疫是在适应性免疫系统被激活之前抵御病原微生物感染的第一道防线，对病原体快速反应，无特异性。作为新描述的淋巴细胞，固有淋巴细胞(Innate lymphocytes，ILC)极大地增强了我们对免疫系统的认识。ILC作为先天免疫系统的重要组成部分，可促进宿主对病原体和微生物的防御，维持组织和器官的稳态，并促进组织重塑、愈合和修复以及肿瘤的发展[5-6]。另一方面，ILC的转录异常和功能失调在自身免疫性疾病的发病机制中起重要作用，与免疫耐受和自身免疫有关。基于许多关于人类疾病的推测模型和研究认为ILC的不同亚群和转录调控网络可能对自身免疫相关的皮肤病和炎症性疾病至关重要；传统治疗银屑病侧重于抑制免疫系统和角质形成细胞增殖，如使用甲氨蝶呤、环孢素和阿维A等[7]。随着对银屑病潜在免疫过程的阐明，生物制剂迅速成为靶向这些途径的调节剂的前沿。本研究通过咪喹莫特诱导银屑病大鼠模型，探讨生物制剂依那西普对银屑病大鼠模型ILC亚群分型的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只6周龄雄性Lewis大鼠(180～200 g)购自中国医学科学院药物研究所，许可证号SYXK(京)2021-0050。将大鼠分组并安置在有垫料的笼子中(每个笼子6只)，用标准啮齿动物食物和水喂养动物，饲养条件：12 h光照和12 h黑暗循环，温度(22±2)℃和湿度(50±15)% 。

1.2 实验试剂及仪器 依那西普(购自Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG，批准文号S20150009)，流式细胞仪分析(购自贝克曼库尔特流式细胞分析仪)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海碧云天生物科技有限公司，批号P0012)；Super Signal West Pico化学发光底物(美国伊利诺伊州罗克福德皮尔斯)。

1.3 银屑病大鼠模型制作和分组 将30只大鼠平均分为三组：对照组、模型组和依那西普组，每组10只。除对照组外，其余各组进行银屑病造模。将62.5 mg咪喹莫特局部应用于剃光的大鼠背部皮肤(限于3 cm×3 cm面积)，持续7 d。当皮肤表面出现鳞屑、红斑及浸润改变，病理检查皮肤角质层增厚或角化不全等说明造模成功[8]。另外，依那西普组大鼠皮下注射200 mg/d生物制剂依那西普，治疗持续7 d。

1.4 实验方法

1.4.1 皮肤炎症严重程度评分：采用银屑病皮损严重程度指数对大鼠皮损部位的红斑、脱屑和增厚评分，分值为0～4分，其中0分表示无症状，1分表示有轻微症状，2分表示有中度症状，3分表示有重度症状，4分表示有极重度症状，分值越高说明大鼠皮损部位的红斑、脱屑和增厚越严重。

1.4.2 流式细胞术检测ILC1、ILC2和ILC3水平：采集大鼠尾部血管血液样本，置入添加25 μl肝素溶液的聚乙烯管中。3000 g、4 ℃离心10 min获取血浆样品。使用红细胞裂解液和固定液裂解红细胞，固定有核细胞。流式细胞仪分析使用三激光/12通道系统行，并使用 Beckman Coulter的专有Kaluza软件1.5 版进行分析。ILC被定义为具有以下标记集的细胞：CD45+、CD127+、谱系标记 CD3、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD20、CD34、CD56、CD94、FcERIa 阴性。此外，ILC1 被定义为 CRTH22 CD1172;ILC2被定义为 CRTH2+CD1172;ILC3被定义为 CRTH22 CD42 CD117+。根据制造商的说明书使用细胞内固定和透化缓冲液。细胞的绝对数量计算如下：ILC绝对淋巴细胞计数(自动计数)=ILC的绝对数量/mm3。

1.4.3 蛋白印迹分析：取大鼠皮肤组织并切成小块于PBS中匀浆，13 000 r/min，离心10 min获取沉淀组织碎片。使用含有蛋白酶抑制剂(500 mmol/L苯甲基磺酰氟)的 RIPA 裂解和提取缓冲液提取蛋白质。根据制造商的方案，使用BCA蛋白质测定试剂盒测量T-bet、GATA3和RORγt、Caspase-3、Caspase-14、丝聚蛋白、外皮蛋白和β-肌动蛋白含量。如前所述将蛋白质样品(50 μg)上样并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用Super Signal West Pico化学发光底物进行抗体标记蛋白质的化学发光检测，并暴露于Kodak XOMAT AR 放射自显影胶片。使用程序 Image J v1.33u 对条带进行光密度分析。

1.4.4 实时PCR分析：使用RNeasy Kit从小鼠背部皮肤活检中提取总RNA，根据制造商的说明使用RT2 First Strand Kit 和 RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix 将其转化为互补 DNA。在 ABI 7300 RT-PCR上进行扩增，并使用 PCR Array Data Analysis Software进行数据分析。计算γ-干扰素 (IFN-γ)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-17(IL-17)和白细胞介素-22(IL-22)的mRNA水平。

2 结 果

2.1 三组大鼠背部皮肤炎症严重程度评分比较 见表1。模型组红斑、鳞屑和厚度评分较对照组升高(均P<0.05)，依那西普组红斑、鳞屑和厚度评分较模型组降低(均P<0.05)。

表1 三组大鼠皮肤炎症严重程度评分比较(分)

2.2 三组大鼠外周血循环ILC谱系分析 见表2。ILC1和ILC3水平比较，模型组高于对照组，依那西普组低于模型组(均P<0.05)；ILC2水平比较，模型组高于对照组，依那西普组低于模型组(均P<0.05)。

表2 三组大鼠外周血循环ILC谱系分析(个/μl)

2.3 三组大鼠转录因子表达水平比较 见表3。模型组T-bet、GATA3、RORγt、Caspase-3蛋白表达较对照组升高(均P<0.05)，而Caspase-14、丝聚蛋白和外皮蛋白的蛋白表达降低(均P<0.05)；依那西普组T-bet、GATA3、RORγt、Caspase-3蛋白表达较模型组降低(均P<0.05)，而Caspase-14、丝聚蛋白和外皮蛋白的蛋白表达升高(均P<0.05)。

表3 三组大鼠转录因子表达水平比较

2.4 三组大鼠组各炎症因子mRNA表达水平比较 见表4。模型组IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17和IL-22mRNA表达较对照组升高(均P<0.05)，依那西普组IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17和IL-22 mRNA表达较模型组降低(均P<0.05)。

表4 三组大鼠各炎症因子mRNA表达水平比较

3 讨 论

银屑病是一种常见的慢性疾病，主要累及皮肤和关节，并且与潜在的遗传易感性和炎症失调有关[9]。虽然没有治愈牛皮癣的方法，但有完善的管理方案。轻度和中度银屑病的一线治疗通常是局部治疗，包括糖皮质激素、维生素D类似物和光疗的组合，而中度至重度银屑病通常需要全身治疗[10]。用于银屑病全身治疗的药物包括小分子药物，如甲氨蝶呤、类维生素A或环孢菌素，以及最近的生物制剂，如单克隆抗体和受体融合蛋白[11]。大多数小分子减少细胞增殖或抑制免疫活性，而生物制剂靶向IL-23/Th17轴和TNF-α信号转导中的炎性细胞因子。本研究使用生物制剂对银屑病大鼠进行了治疗，并探讨对ILC亚群表达的影响机制。

银屑病是一种免疫介导的炎症性和主要皮肤嗜性的疾病，具有多因素症状，由先天和适应性免疫系统的细胞和分子介导。遗传和环境因素都与银屑病的发病有关。证据表明，Th17标志性细胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22在银屑病中起主要作用，Th17细胞是这些致病细胞因子的主要来源[12-14]。然而，侵入皮肤的γδT细胞和RORγt+ILC分泌IL-17A、IL-17F和IL-22，成为大鼠急性银屑病样病变形成的重要诱因，表明先天免疫失调参与银屑病斑块的形成。银屑病中观察到的表皮增厚是由IL-23介导的，IL-23由树突状细胞和角质形成细胞过度产生，它们刺激真皮内的Th17细胞产生IL-17A和IL-22。在健康的皮肤和血液中，ILC2和ILC3以低水平存在并表达皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)，因此具有定位于皮肤的能力[15-17]。在咪喹莫特诱导的银屑病实验小鼠模型中，已经证明先天淋巴细胞之间的串扰在该疾病的发病机制中显得至关重要。事实上，RORγt+γδT细胞和ILC3代表了银屑病斑块中IL-17和IL-22的主要早期生产者，并且值得注意的是，通过比较缺乏所有淋巴细胞亚群的Rag2/-IL2rcg/小鼠与Rag1/小鼠，仅缺乏T和B细胞，ILC3和γδ T细胞导致银屑病斑块形成是必要和充分的[18-20]。通过使用免疫组织化学分析，本研究发现生物制剂对ILC亚群分型有调控作用，与对照组大鼠相比，模型大鼠有较高水平的ILC1和ILC3分型及较低水平ILC2，而生物制剂干预治疗后逆转了模型大鼠的ILC亚群失衡，并调控相应的转录因子和炎症因子的表达。在介导先天免疫反应中细胞因子通过Th-17、Th-1和Th-22系统启动T细胞介导的适应性免疫反应，并导致IL-5、IL-13、IL-17、IL-22和IFN-γ的mRNA表达。因此，Th-1和Th-17细胞因子均诱导角质形成细胞产生IL-20，从而在自动扩增步骤中增加细胞的增殖。此外IL-6和TNF-α由角质形成细胞产生并有助于树突状细胞的活化，从而促进和增加表皮炎症的严重程度。本研究发现，生物制剂通过调控ILC亚群分型变化影响模型大鼠炎症因子的水平，通过RT-PCR分析发现，与模型组大鼠相比，生物制剂组IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17和IL-22 mRNA表达降低。研究还表明，生物制剂能减少细胞凋亡程度的发生(蛋白印迹分析显示模型组Caspase-3下调)，与模型组相比，生物制剂上调Caspase-14、外皮蛋白和丝聚蛋白的蛋白表达水平来维持表皮的稳态以及功能和结构的完整性，从而改善皮肤状况。

综上所述，生物制剂依那西普可通过调控ILC亚群分型进而调控相应的转录因子和炎症因子的表达,从而达到减缓银屑病的作用。