保健食品中黄曲霉毒素检测方法的研究

肖雪梅，曾冬燕，邱 妹，秦 菁，黄 玲

（汤臣倍健股份有限公司，广东 珠海 519040）

由于黄曲霉素是一种致癌物质，如果不小心误食了黄曲霉素，积累过多会导致身体内的癌细胞病变，从而导致癌症。一些食物含有黄曲霉素，消费者一定要先了解食物所含成分再吃。检测黄曲霉毒素的方法有很多，如薄层分析法（TLC）、液相色谱法（HPLC）、酶联免疫法（ELISA）[1-5]，现在主要研究酶联免疫法（ELISA），因为该方法具有检测速度快、灵敏性高、选择性强等优点，但该方法会存在假阳性的现象，而且试剂盒需低温保存、只能用1 次，不能循环使用[6-9]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

酶标仪（Multiskan FC）；离心机，上海安亭科学仪器厂产品；洗板机（Thermo）。

黄曲霉毒素B1检测试剂盒，河北伊莱莎生物技术有限公司提供；氯化钠、无水甲醇、三氯甲烷、无水硫酸钠，广州化学试剂厂提供；实验室用水（纯化水）。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

70%甲醇/水溶液体积比70∶30。

1.2.2 样品前处理

①称取5 g 样品于50 mL 离心管中，加0.5 g NaCl，再加入25 mL 甲醇/水溶液；②盖好盖子高速振荡3 min（或摇床振荡 10～15 min），静置 5 min（或以转速4 000 r/min 离心5 min） 后用定量滤纸过滤，收集滤液，此为样品待检液。注意：如果收集的滤液颜色比较深，则需要提油。提油的方法为吸取中层甲醇/水溶液4 mL 于分液漏斗中，加8 mL三氯甲烷，振摇2 min，静置分层，将下层三氯甲烷层尽量完全放入第2 只分液漏斗中，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分成。采取相同的方法，在分液漏斗中再加5 mL 三氯甲烷，收集三氯甲烷层一并经盛有约10 g 预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢性滤纸过滤于50 mL 圆底烧瓶中，最后用少量三氯甲烷清洗过滤装置，洗涤于圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在65 ℃条件下蒸干，加入70%甲醇/水溶液4 mL 后溶解，为待检液。

1.2.3 免疫检测程序

（1） 清洗液的准备。根据需要量将浓缩液稀释10 倍，取10 mL 10 倍浓缩清洗液到90 mL 蒸馏水中混匀待用。配好的清洗液倒入带盖容器中于室温下保存，下次试验可以再用（注意不要污染）。

（2） 回温。从冰箱取出试剂盒，让试剂盒恢复至室温后，分别取出所需要的测试孔和混合孔。

（3） 加板。第一步，加入100 μL 酶标记物（Conjugate Solution）到每个混合孔中；第二步，加入50 μL标准及样品到相应混合孔中，混匀，用移液器转移100 μL 到相应的测试孔；第三步，加入50 μL 抗体（Antibody Solution） 到相应的每个微孔中，注意使用一次性吸头防止交叉污染。

（4） 反应。室温下让测试孔避光反应10 min。

（5） 洗板。用洗板机进行洗板，先在洗板机上设置好洗4 次板、重复3 次的程序，在缓冲液瓶装上所对应的缓冲液，根据实际情况选择所需要的列数，按“START”键进行洗板。

（6） 显色。在每个反应孔中加入100 μL 底物溶液（Substrate Solution），室温下反应5 min（如果颜色浅可适当延长显色时间）。

（7） 终止。每孔中加入 100 μL 停止液 （Stop Solution）。

（8） 仪器测定。于波长450 nm 处酶标仪读取吸光度。

1.2.4 影响因素及注意事项

（1） 试剂盒里面的混合杯存在有抗体的风险，所以建议不用试剂盒自带的混合杯，否则会影响吸光度的结果。

（2） 洗板机的固定规格是8×12 个孔，如果做样的时候列数没有8 个，需要用混合杯补够8 个孔，再进行洗板。如果洗完板发现没有完全干，可以用吹风机进行吹干。

（3） 在每个检测步骤进行加样或试剂时要直接加到反应孔的底部，不能加到孔壁上，同时加完之后不能有气泡。

（4） 在显色时加100 μL 底物溶液的时候，这个过程需要快，如果样品超过20 份的数量，建议用多道移液枪进行加液，以防做出来的标准不呈梯度。

（5） 对于不同批次的试剂盒，里面的反应孔和试剂不能混用。

（6） 对于用完的试剂盒和有接触到标样的器皿，不能直接扔掉，都需要用5%次氯酸钠或漂白粉浸泡半天后再进行处理，备用。

2 结果与分析

2.1 样品的检测

该试剂盒有5 个浓度的标准品，分别为0，2.0，4.0，12.5，50.0 μg/L，于是随机选了3 个不同的原料和2 个成品用上述所描述的方法进行检测.

酶标仪检测的结果见表1。

表1 酶标仪检测的结果

结果将由酶标仪（Multiskan FC） 的软件根据5 个标准品的吸光度来绘制ELISA 标准曲线，根据标准曲线的浓度和吸光度做出标准曲线（图1），根据标准曲线可以计算出样品中的黄曲霉B1具体的含量，5 个样品的标准参照＜4 mg/L标准品来进行判定。

ELISA 标准曲线见图1。

由表1 的吸光度和图1 的标准曲线图可以看出，这5 个样品的黄曲霉毒素的结果都低于相应的允许限量，属于阴性样品，说明该保健食品中3 个原料和2 个成品的黄曲霉B1含量都没有超标。

图1 ELISA 标准曲线

样品中黄曲霉毒素B1含量见表2。

表2 样品中黄曲霉毒素B1 含量

2.2 回收率与精密度

2.2.1 回收率

由国家标准GB 5009.24—2016 第四法酶联免疫法规定选取大豆分离蛋白或其他稳定的阴性样品，根据所购买的黄曲霉试剂盒的检出限，在阴性条件中添加3 个不同浓度水平的AFTB1标准溶液，按照说明书操作方法，用读数仪读数。于是选取了不同品种的产品对河北伊莱莎黄曲霉毒素B1检测试剂盒进行验收，测定回收率。

AFTB1 标准液回收率见表3，不同产品回收率见表4。

表3 AFTB1 标准液回收率

表4 不同产品回收率

国家标准GB 5009.22—2016 中规定，针对每个加标浓度，回收率在50%～120%允许范围内的该批次试剂盒均可使用。综合表3 和表4 的结果可以看出，其回收率范围都在规定的范围内。

2.2.2 精密度

为了符合国家标准GB 5009.22—2016 精密度的要求，于是对该试剂盒的标准品进行检测。

检测结果见表5。

表5 检测结果

国家标准GB 5009.22—2016 中规定其分析结果的相应相差应不大于20%。于是，其精密度也是在允许的范围内。

2.3 结果与分析

由表1、图1、回收率和精密度可看出，酶联免疫法测保健食品中的黄曲霉毒素B1具有灵敏度高、特异性强、回收率和精密度都比较高的超微量分析技术，且结果准确，可满足标准的要求和客户的需求。

3 结语

黄曲霉毒素虽然可怕，也存在于很多地方，但在保健食品中还是挺安全的，而测定黄曲霉的方法有多种，但酶联免疫法一直以来都被许多科研工作者认可及推崇，该方法是一种敏感性高、特异性强、重复性好的试验判定方法。由于该方法是一种限量方法，所以能快速检测出保健食品中黄曲霉毒素是否在合格的标准范围内。该方法的使用使我国在保健食品行业中测定黄曲霉毒素提高到一个新的水平[10-14]。