超声辅助法提取蒲公英多糖及抗氧化活性研究

舒玉凤，卢静静，陈 旭

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北 武汉 430205）

蒲公英 （Taraxacum mongolicum） 味微苦，寒性，具有清热解毒和利尿等功效[1]，多糖作为蒲公英中的活性成分，具备增强机体免疫力、降低血脂、预防衰老和抗辐射等功能，在医疗和保健方面具有重要的潜在应用价值[2-3]，因此蒲公英中多糖提取的研究越来越引起人们的关注。现在国内外比较普遍的使用酶解法和热水浸提法提取蒲公英中的多糖[4-5]。与前两者提取法相比较，超声波辅助提取具有用时短、容易操作、效果良好等特点，已应用于植物有效成分的提取[6]，但在蒲公英多糖提取方面有关的报道不多。

自由基又称游离基，能够破坏细胞的化学物质，破坏机体内的遗传基因组织、酶、脂肪、碳水化合物等，进而导致食品发生腐败变质。为有效扼制食品中有害微生物的生长和减缓其被氧化变质的过程，目前主要通过添加防腐剂和抗氧化剂，但工业合成的抗氧化物存在较多安全隐患。从食物和天然产物中寻找活性物质，开发抑菌、抗氧化、降低血糖、血脂及高血压等功能性食品或药物成为现下研究的热门[7]。据文献报道，天然活性成分可提供氢离子或螯合金属离子，达到清除自由基的目的[8]，所以研究植物及中药提取物对抑制其产生具有重要意义。

利用超声波辅助水提法提取蒲公英多糖，探究各因素对蒲公英多糖得率的影响，并对此进行优化以确定最佳提取条件，同时研究蒲公英多糖抗氧化活性，为进一步研究和开发蒲公英多糖寻找较为恰当的提取方法和条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒲公英，购自当地中药店；葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇、三氯化铁、硫酸亚铁、DPPH、H2O2和邻苯三酚试剂，均为国产分析纯；试验用水为蒸馏水，购自屈臣氏。

1.2 仪器与设备

UV-1800 CP 型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；FW-200 型高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司产品；HH-S4 型数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司产品；MEC 型超声波清洗机，深圳市明和超音波工业股份有限公司产品；DHG-9240（A） 型电热鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品；TDL-5-A 型离心机，上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

选取无虫蛀、无霉斑的干燥蒲公英植株，置于高速粉碎机中粉碎，过60 目筛，将制备的蒲公英粉末采用索氏抽提法在50 ℃条件下，用石油醚回流处理4 h 后得到脱脂蒲公英粉末，过筛干燥备用。

1.3.2 蒲公英多糖提取工艺

称取适量脱脂蒲公英粉，加入去离子水搅拌均匀，热水浸提后取出室温下冷却。以转速4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入3 倍体积的95%乙醇，密封后于4 ℃的条件下静置24 h，再次以转速4 000 r/min 离心20 min，数次清洗沉淀，将沉淀用去离子水溶解并定容至100 mL，于波长490 nm 处测定吸光度。通过标准曲线计算多糖含量[13]，并按照公式计算蒲公英多糖得率。

式中：m1——多糖质量，g；

m2——样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

以蒲公英粉末为试验原料，利用超声波辅助热水浸提法，研究提取时间 （60，90，120，150，180 min）、超声功率 （40，80，120，160，200 W）、提取温度 （50，60，70，80，90 ℃） 和料液比 （1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50） 对多糖得率的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验条件下，将Box-behnken 试验作为依据设计试验原理，将蒲公英多糖得率作为响应值进行响应面试验，并验证最佳提取工艺条件。

响应面因素与水平设计见表1。

表1 响应面因素与水平设计

1.3.5 抗氧化活性测定

（1） DPPH·清除能力的测定。参考文献[9-10]。准确取2.0 mL 不同浓度的样品溶液和0.1 mmol/L 的DPPH 溶液2.0 mL 混合，充分摇匀，避光反应30 min，以无水乙醇作为空白，于波长510 nm 处测定吸光度。以维C 作为对照品，试验3 次，取平均值。

（2） 羟基自由基（·OH） 清除能力的测定。参考文献[9-10]。分别取不同浓度样品溶液1.0 mL，加入 6 mmol/L 的 FeSO4溶液 1 mL，6 mmol/L 水杨酸 -乙醇溶液 1 mL 和 6 mmol/L 的 H2O2溶液 1 mL，于37 ℃下水浴400 min，然后于波长510 nm 处测定吸光度。以相同浓度的维C 作为对照，以相同体积的蒸馏水作空白组，试验3 次，取平均值。

（3） 超氧阴离子自由基 （O2-·） 清除能力的测定。参考文献[9-10]。分别取不同浓度的样液2.0 mL，然后加入2.5 mL 浓度为0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液（pH 值8.8）。室温下混匀后加入浓度为6 mmol/L的邻苯三酚溶液0.1 mL 后开始计时5 min，每隔30 s记录波长320 nm 处的吸光度。以相同浓度的维C 作为对照，以相同体积的蒸馏水作空白组，试验3 次，取平均值。

1.3.6 数据统计分析

所有试验均平行3 次，取平均值。单因素及抗氧化试验数据采用Origin 8.0 软件处理，响应面优化试验采用Design Expert.V 8.0.6 软件分析，并进行模型方差分析。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助提取蒲公英多糖的研究

2.1.1 单因素试验

不同超声时间、超声功率、提取温度和料液比对蒲公英多糖得率的影响见图1。

由图 1 （a） 可知，提取时间在 1.0～2.5 h 过程中，蒲公英多糖得率与时间呈正相关，在2.5 h 时多糖得率达到峰值，为58.6 mg/g，随着提取时间增加至3 h 时，蒲公英多糖得率开始下滑。这可能是因为蒲公英中的多糖随着超声波引起的热量汇集而开始溶解[11]，从而使多糖得率下跌。因此，超声时间选择2.5 h。由图 1（b） 可知，超声功率为 40～120 W时，蒲公英多糖得率随与超声功率呈正相关，功率为120 W 时多糖的得率达到峰值，为73.3 mg/g，继续增大功率，多糖得率开始下滑。主要原因可能是超声功率加大，剧烈的机械作用使得分子扩散速度加快，蒲公英多糖更容易渗出，但是机械功率过大之后，蒲公英中其他水溶性物质也被提取出来与多糖发生反应，从而使多糖得率下降。综合实际因素，超声功率定为120 W。由图1（c） 可知，提取温度为50～80 ℃时，蒲公英多糖得率与提取温度呈正相关。在80 ℃时多糖得率达到最峰值，为59.6 mg/g，随着提取温度的升高，多糖的得率逐渐下降。可能是在超声条件下细胞中内容物的扩散更方便，使多糖的溶出更容易[11]，当温度大于80 ℃时，超声温度过高使糖苷键发生断裂，从而多糖得率有所下降。所以提取温度为80 ℃。由图1（d） 可知，在料液比为1∶20 时，蒲公英多糖得率最达到峰值，为68.3 mg/g，继续增加料液比，蒲公英多糖得率减小，这是由于在超声条件下，溶剂含量较大，蒲公英中其他水溶性杂质也容易溶出，经过浓缩之后，多糖与其发生反应，从而使多糖得率下降。最佳料液比为1∶20（g∶mL）。

图1 不同超声时间、超声功率、提取温度和料液比对蒲公英多糖得率的影响

2.1.2 响应面优化试验

（1） 响应面试验结果及方差分析。

响应面设计方案和试验结果见表2。

表2 响应面设计方案和试验结果

采用Design Eexpert V8.0.6 软件对表2 中试验结果进行多项拟合回归，得到蒲公英多糖得率对超声时间（A）、超声功率（B）、提取温度（C） 和料液比（D） 的二次多项回归模型方程：

回归方程系数显著性检验和方差分析见表3。

由表3 可知，模型的p＜0.000 1＜0.01，差异极显著；失拟项的p 值为0.052 4，不显著，说明模型稳定，数据没有异常点；决定系数R2=0.999 7，调整确定系数R2Adj=0.999 4，响应值的变化有99.94% 来源于所选的超声温度、超声时间和料液比3 个因素，说明模型拟合程度可靠，回归方程能很好地展现各因素与响应值之间的关系。考查p 值与F 值大小，可知料液比的影响最大，提取温度次之，超声时间其后，超声功率的影响最小。

表3 回归方程系数显著性检验和方差分析

各因素交互作用对蒲公英多糖得率的响应面见图2。

响应曲面坡度体现了响应值面对操作条件改变的灵敏程度，即曲面陡峭度与多糖得率对于超声时间、提取温度、提超声功率、料液比4 个条件的改变呈正相关。由图2 可知，各因素交互作用的影响顺序为 BC＞AD＞CD＞AC＞AB＞BD，与表 3 结果一致，即超声功率和提取温度曲面最陡峭，两者交互作用对蒲公英多糖得率影响最大。而提取温度和料液比的交互作用响应面较平缓，说明提取温度和料液比的交互作用对蒲公英多糖得率影响不大。

2.2 最佳工艺条件验证

通过回归模型预计测得超声波辅助提取蒲公英多糖的最佳工艺条件为超声时间154.2 min，超声功率136.55 W，提取温度82.52 ℃，料液比1∶22.33（g∶mL），此条件下蒲公英多糖得率89.38 mg/g。

根据实际试验条件调整提取工艺。超声波辅助提取蒲公英多糖的工艺条件为超声时间154 min，超声功率137 W，提取温度82.5 ℃，料液比1∶22（g∶mL）。

根据调整后工艺条件，设置5 组平行试验进行试验验证。结果表明，超声波辅助提取蒲公英多糖得率88.62±0.18 mg/g，与理论值相差微小，证明该回归模型获得了较为准确的优化参数。

3 结论

通过单因素试验和响应面分析法优化超声波辅助提取蒲公英多糖工艺参数。结果表明，超声波辅助法提取蒲公英多糖的最佳条件为超声时间154 min，超声功率137 W，提取温度82.5 ℃，料液比1∶22（g∶mL），此条件下多糖得率可到达88.62 mg/g，说明超声波辅助提取法对蒲公英多糖的提取有较为明显的增强作用，是一种操作性强且经济有效的提取方法。在各影响因素中，影响最大的是料液比，超声功率和提取温度两者交互作用对蒲公英多糖得率影响最显著。方差分析中决定系数R2为99.97%，变异系数为0.54%，说明试验的数据稳定、可靠，为蒲公英多糖提取的生产提供了理论依据。

试验还研究了最优工艺条件下提取的多糖在抗氧化性能力方面的效果。结果表明，蒲公英多糖对DPPH·，·OH 和 O2-·3种自由基均有一定清除作用，对DPPH·自由基清除率较强[12]，可用于天然抗氧化剂开发或功能性食品原料。综上所述，试验所提供的超声波辅助提取蒲公英能显著提高多糖得率。同时，有效保护了多糖的抗氧化活性，为蒲公英的深度开发提供了一定技术支持和理论依据。