HPLC-ELSD法测定参子安胎片中黄芪甲苷的含量

2022-08-16李凯锋王秀芳

昆明学院学报 2022年3期

李娅，汪蓉，李凯锋，王秀芳

(昆明学院化学化工学院，云南昆明 650214)

黄芪中的重要成分是多糖类和黄芪苷，其中黄芪苷又可以细分为黄芪Ⅰ、黄芪Ⅱ、黄芪Ⅳ，黄芪苷中生物化学活性最高的部位为黄芪Ⅳ，亦称黄芪甲苷.黄芪甲苷(化学结构式见图1)为环阿尔廷型三萜皂苷类化合物，是黄芪专属性活性成分，其作为黄芪质量控制指标被历版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)所收载[1].黄芪甲苷对人体具有良好的机体免疫调控、抗炎、耐药、抗病毒、器官保护[2]和神经细胞保护等功能[3-4].其不仅完全具备其他黄芪植物多糖的特殊功效，而且还具有一些新的特点使它拥有其他常规黄芪植物多糖中所无法与之相比较的强大功效，其中所具有的抗病毒功效和抗菌作用反应强度大约相当于其他多种常规药用黄芪植物多糖的2倍多，对于多种病毒的抗菌作用更是其他常规黄芪植物多糖的30倍多，由于它的成分含量少，效果好，因此使它拥有“超级黄芪多糖”的美誉.黄芪甲苷的含量测定检验方法最常见的有薄层扫描法、近红外波谱法[5]、高效液相色谱法、高效液相色谱-蒸发光散射法等.

参子安胎片是昆明市中医医院制剂室研制生产的中药制剂，原名保产达生片，主要由当归、黄芪等药材组成.具有养气血、益阴精、充盈胞脉冲任、强健母体的功效[6].由于该样品为院内制剂，在《中国药典》中没有关于参子安胎片的黄芪甲苷含量测定的记录，为此，本研究建立了高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)联用法对其含量进行测定，以期为参子安胎片中黄芪甲苷的含量测定提供参考.

图1 黄芪甲苷结构式

1 试剂和仪器

分析纯试剂购于国药集团化学试剂有限公司；色谱纯试剂购于Fisher Chemical；黄芪甲苷对照品(纯度96.9%)购于中国食品药品检定研究院；参子安胎片的产源来自昆明市中医药制剂中心(编号:200825，200827，200828).HPLC-ELSD仪(Agilent 1260，安捷伦科技有限公司).

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品 0.005 421 g 于 25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制成每 1 mL 中含 0.216 8 mg 的溶液，即得黄芪甲苷对照品溶液.

2.1.2 供试品溶液的制备

取参子安胎片粉末 9 g，精密称量其质量，置于 250 mL 的具塞锥形瓶中，用量筒量取甲醇 100 mL 加入其中，放置在水浴锅上冷凝回流 1.5 h.取出放冷，取上清液过滤，过滤后的滤纸重新放入锥形瓶中，再加入50 mL甲醇于该锥形瓶中，然后放入超声波清洗机中，100 W 超声 20 min.放冷后再次取上层清液过滤，滤纸重新放入锥形瓶中，加入 50 mL 甲醇，再放入同一台超声波清洗机中超声.合并甲醇提取液于蒸发皿中，在水浴锅上蒸发至近干，加入 25 mL 热水溶解，用玻璃棒将溶解后所得的溶液转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇溶解提取4次，每次 40 mL，合并正丁醇提取液.再用氨试液洗涤正丁醇提取液2次，每次 50 mL，弃去氨试液，合并正丁醇溶液.合并后的正丁醇溶液在水浴锅上蒸发至近干，用甲醇溶解残渣，移入 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用 0.45 μm 有机滤膜和注射器缓慢推入液相小瓶里，摇匀，即得到供试品溶液.

2.1.3 阴性样品的制备

参子安胎片阴性样品指参子安胎片中除没有黄芪成分外，其他成分都不变的样品.称取 9 g 左右的参子安胎片阴性样品，精密称量，其他步骤与“2.1.2”项下的步骤一致.

2.1.4 色谱条件

色谱柱为安捷伦SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温 30 ℃，流动相V(乙腈)∶V(水)=32∶68，工作流速为 0.8 mL/min，雾化器工作温度 40 ℃，蒸发管工作温度 90 ℃，气体流速 1.6 L/min，运行时间 45 min.

2.2 测定方法

分别精密吸取 20 μL 的供试品溶液以及3，10 μL 对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，则可得到其色谱图.以外标两点法对数方程计算，即可得到供试品的含量.

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验

取阴性样品，按照“2.1.3”项下阴性样品的制备工艺制成阴性供试品溶液.精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各 20 μL，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图.从图2～图4可以看出，在与对照品的色谱峰共同相应曝光位置上，供试品溶液同样具有与对照品色谱峰相应的曝光时间和相同的色谱峰，而阴性样品溶液则在此处对应的位置上无任何色谱峰.

图2 参子安胎片阴性样品色谱图

图3 黄芪甲苷对照品色谱图

图4 参子安胎片供试品色谱图

2.3.2 线性关系考察

精密吸取配制好的对照品溶液3，6，10，15，20，25，30 μL，分别注入高效液相色谱仪中，按照“2.1.4”色谱条件测定峰面积.以lgρ(进样量)为横坐标，lgS为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=1.790 7x+1.691 6，R2=0.999 8.测定结果显示，进样量在 0.630 3～6.303 3 μg 的范围内具有非常高的线性关系，结果见表1与图5.

表1 线性范围考察结果

图5 标准曲线

2.3.3 精密度实验

取批号为200825的样品，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备工艺方法进行制备，然后精密吸取 20 μL 的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测定色谱峰面积，结果见表2.RSD为0.93%，表明所检测的数据精密度良好.

2.3.4 稳定性实验

取批号为200827的供试品，按照“2.1.2”项下供试品溶液的制备工艺方法进行制备，分别在规定时间配制后0，4，8，12，16 h，按照规定的方法进行测定，结果见表3.结果显示，供试品溶液在 16 h 内稳定.

表2 精密度实验结果

表3 稳定性实验结果

2.3.5 重复性实验

取批号为200827的样品，并按照“2.1.2”项下供试品的制备工艺方法，平行制备6份实验用的供试品溶液，然后用相同方法对其进行测定，得到平均含量为 0.117 4 mg/g，RSD为1.73%.表明所采用方法的测定工艺具有较高的重复性.

2.3.6 加样回收率实验

精密称取200827批号中已知含量的参子安胎片样品6份(其中黄芪甲苷的含量为 0.117 4 mg/g)，分别在样品中准确加入黄芪甲苷对照品适量，按照“2.1.2”项下供试品溶液制备工艺方法混合成供试品溶液，用相同方法进行测定，同时计算样品的回收率，得到平均回收率为99.54%，RSD为2.58%(n=6).结果见表4.

表4 加样回收率实验结果

2.3.7 定量限和检出限实验

1)定量限.取 9.005 5 g 供试品，按照“2.1.2”项下方法进行制备，依次取 1 mL 的对照品溶液定容至 5 mL 的容量瓶中，摇匀.用 0.45 μm 的有机滤膜和注射器缓慢推入液相小瓶中，进样 20 μL，测定其峰面积，结果见表5.

2)检出限.取 9.005 5 g 供试品，按照“2.1.2”项下方法进行制备，依次取 0.5 mL 对照品溶液，用甲醇定容至 5 mL 的容量瓶中，摇匀.然后用 0.45 μm 的有机滤膜和注射器将其缓慢推入液相小瓶中，进样 20 μL，测定其峰面积，结果见表5.

表5 定量限和检出限

2.4 样品含量测定

取3个批号的参子安胎片，并按照“2.1.2”项下供试品溶液的制备工艺方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液 20 μL，注入高效液相色谱仪中进行测定，同时计算黄芪甲苷的含量.从表6可以看出，不同批号的参子安胎片中黄芪甲苷的含量不同，其平均值为 0.087 8 mg/g.

表6 黄芪甲苷的含量测定结果

3 讨论与小结

3.1 讨论

3.1.1 溶剂的选择

在溶剂的选择方面，本研究分别使用甲醇和80%甲醇考察参子安胎片样品的处理效果.结果表明，用80%甲醇处理的样品所得结果在本检测条件下均出现不同程度的干扰，且所测得的含量较低，因此最终选择使用甲醇溶液处理样品.实验结果显示，本方法提取效率高、分离速度快，测定时无明显的干扰，稳定性和重现性均能够满足分析的要求.值得注意的是，正丁醇萃取液合并在一起后应再采用氨试液萃取2次，以提高其检测含量，降低目标峰的干扰.

3.1.2 色谱柱的选择

本研究分别考察了Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)和XBridge C18(5 μm，4.6 mm×250 mm) 两种色谱柱的分离效果，发现两种色谱柱均可对样品进行有效的分离，但相较于XBridge C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)的分离效果更加明显，分离度更高，最终采用Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱.

3.1.3 流动相的选择

参考《中国药典：一部》(2015年修订版)中黄芪含量测定实验项下的方法，采用乙腈-水为流动相，考察了V(乙腈)∶V(水) =32∶68[7]、V(乙腈)∶V(水) =30∶70、V(甲醇)∶V(水)=80∶20这3种流动相.结果显示，供试品溶液在采用V(乙腈)∶V(水) =32∶68的色谱测定体系中能有效地洗脱黄芪甲苷后充分取出，且能够达到很好的基线分离，因此选择V(乙腈)∶V(水)=32∶68作为流动相.