河南省新生儿11种氨基酸及31种酰基肉碱正常参考区间建立

李 铭 杨永俊 任利娟 郭孝兰

河南省生殖健康科学技术研究院，国家卫生健康委出生缺陷预防重点实验室，河南省人口缺陷干预技术研究重点实验室(郑州，450002)

遗传代谢病又称先天性代谢缺陷(IEM)，是维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和(或)蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷，即编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变，引起系列临床症状的一组疾病[1]。通过能够检测干血滤纸片中的多种氨基酸及酰基肉碱的串联质谱技术对新生儿干血斑样本进行检测，可以降低遗传代谢病种群的筛查难度，进而早期准确地进行针对性的检查和临床干预[2]。本研究旨在通过串联质谱法对河南省各地市的52 979例新生儿干血斑样本氨基酸及肉碱进行分析，建立河南正常新生儿的干血滤纸片遗传代谢病指标筛查的参考区间，以期为本地区临床检验提供有效可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本收集

收集2016年1月-2020年10月河南省18个地市送至本实验室筛查的新生儿干血斑标本，样本来源覆盖河南省所有地级市。按照《新生儿遗传代谢病筛查》[3]的规定，剔除未渗透、血斑面积不够、采血时间不足及质控值超过均值±2SD的标本共149 943例，选取正常出生体重、足月、健康新生儿52 979例筛查结果本进行统计。

1.2 主要仪器和试剂

串联质谱仪(AB公司API3200MD)，恒温孵育振荡器(PerkinElmer)，数控声波清洗器(KQ3200DE)，非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒(PerkinElmer)。

1.3 试验方法

按照非衍生法多种氨基酸、肉碱测定试剂盒说明书操作。

1.4 试剂性能验证

根据中华人民共和国行业标准WS/T 420-2013《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》[4]相关要求，对检测仪器正确度、精密度、可报告范围进行性能评价。本研究的检测系统经过验证，检测结果稳定、可靠。

1.5 统计方法

应用SPSS 26.0软件对数据进行分析，检测指标采用百分位数法，取P0.5～P99.5的值作为参考区间；不同实验室检测结果比较采用Z检验进行差异比对，Z>45.95认为两组参考区间有差异。

2 结果

2.1 新生儿遗传代谢病发病率

对河南省2017-2020年各地区送本实验室筛查的新生儿干血斑标本149 943例进行遗传代谢病筛查，共筛查出经基因确诊的遗传代谢病7种。见表1。

表1 遗传代谢疾病实测发病率与既往报道发病率对比

2.2 11种氨基酸、31种酰基肉碱检测结果与中国临床机构测定值比较

本实验室与中国临床机构检测结果比较，除缬氨酸(VAL)、精氨酸(ARG)、蛋氨酸(MET)、脯氨酸(PRO)有显著差异(Z>45.95)外，其余无显著差异。结果见表2，3。

表2 11种氨基酸检测结果与中国临床机构测定值比较

表3 31种酰基肉碱检测结果与中国临床机构测定值比较

2.3 与其他地区参考区间比较

根据本实验室11项氨基酸和31项酰基肉碱检测结果，取P0.5～P99.5的值作为参考区间，得出河南省正常新生儿干血斑中氨基酸及酰基肉碱正常参考区间，将其与甘肃省[8]作对比，11种氨基酸的参考区间差别较大，除TYR、MET外，其余9种氨基酸甘肃省的参考区间较河南省的参考范围大，31种酰基肉碱除C0、C2外其余29种酰基肉碱的参考区间差别较小，结果见表4。

表4 11种氨基酸和31种酰基肉碱参考区间与甘肃地区比较(μmol/L)

名称河南(P0.5～P99.5)甘肃(P0.5～P99.5)名称河南(P0.5～P99.5)甘肃(P0.5～P99.5)ARG0.825～42.7901.29～46.26C10:10.020～0.1520.02～0.15LEU75.813～289.82065.49～360.58C10:20.005～0.0420.01～0.14MET6.904～38.9762.35～33.64C120.020～0.2520.02～0.20PHE28.267～91.31922.42～104.88C12:10.012～0.1890.01～0.17TYR36.094～270.51029.17～240.99C140.061～0.3610.05～0.38CIT6.058～29.3733.28～53.65C14:10.023～0.2490.02～0.20PRO95.473～353.15165.04～425.70C14:20.005～0.0480.00～0.03C08.303～44.6847.25～58.68C14 OH0.003～0.0380.00～0.03C24.614～39.2821.34～33.64C160.866～6.1970.38～6.05C30.542～4.3510.29～4.46C16:10.038～0.4400.02～0.39C3DC+C4 OH0.038～0.3770.02～0.28C16 OH0.006～0.0530.00～0.04 C40.069～0.4080.06～0.42C16:1OH0.009～0.0700.01～0.11C4DC+C5 OH0.095～0.5070.08～0.41C180.287～1.5610.20～0.59C50.047～0.3120.04～0.49C18:10.548～2.5210.40～2.84C5:10.002～0.0290.00～0.01C18:20.070～0.6490.06～0.66C5DC+C6 OH0.033～0.2180.03～0.29C18 OH0.003～0.0300.00～0.03C60.011～0.0890.01～0.09C18:1 OH0.008～0.0510.01～0.06

3 讨论

遗传代谢病的种类繁多，临床表现复杂，总体患病率高，若得不到及时的诊治常可致残，甚至危及生命。本研究对河南省149 943例新生儿干血斑标本进行遗传代谢病筛查，共筛查出遗传代谢病7种，其中苯丙酮尿症发病率最高，高于国内平均发病率(1/11 144)[9]，与孟云等[5]报道的河南省257 4258例新生儿苯丙酮尿症筛查发病率(1/6567)接近。甲基丙二酸血症发病率低于朱昕赟等[6]报道的(1/6032)，但仍高于国内平均发病率(1/35 000～1/104 000)[10]。苯丙酮尿症和甲基丙二酸血症是河南省发病率较高的两种遗传代谢病，而在临床症状出现前及时治疗，能有效降低疾病带来的后遗症。

新生儿遗传代谢病筛查是早期发现遗传代谢病的有效方法，可为部分在新生儿期尚未出现症状的疾病提供早期诊断早期干预的可能性，使患儿获得早期的诊断和治疗，避免和减少智力残疾儿的发生。目前被应用较为广泛的筛查技术为串联质谱技术，串联质谱该技术可以一次性检测30～50种氨基酸、有机酸、脂肪酸等多种遗传代谢病筛查指标，具有很高的社会效益和经济价值，其科学性、临床价值和社会意义受到大家共同认可[11]。但串联质谱技术的筛查敏感性很大程度上依赖于界值的选择，目前国内尚无共识，而且不同地区及不同实验室所用的界值也不相同。在不同的地区进行大规模数据分析，为每个实验室建立参考值是优化常规实验室和避免错误诊断的最合适宜的方法。

氨基酸和酰基肉碱的界值是用于评价新生儿是否患有遗传代谢病的指标，而不恰当的界值可能导致假阴性或者假阳性，造成临床判读的偏差，国家卫生健康委临床检验中心2017年室间质量评价计划临床判断值的调查结果显示，实验室的临床判断值出现较大差异，35%的实验室氨基酸和酰基肉碱临床判断值与预期结果不一致。分析原因发现，除其中32%的实验室检测浓度存在系统误差外，68%的实验室是由于界值设置不合理造成的[12]。国家卫生健康委员会临床检验中心新生儿遗传代谢病筛查室间质评委员会提出[13]：由于新生儿筛查疾病患病率较低，建议依据患病率高低，选用第99.5百分位值与第0.5百分位值或第99.9百分位值及第0.1百分位值作为界值的上下限[13]。随着百分位数的增大，筛查假阳性率降低，筛查疾病的阳性预计值增高，但假阴性率相应增高[14]。因此，本研究采用的参考区间百分位数为P0.5～P99.5。

本研究采用回顾性分析方法，对河南省52 979例足月、正常出生体重健康新生儿的结果进行分析，得出河南省非衍生法串联质谱检测氨基酸及酰基肉碱的正常参考区间，同时将本研究所得检测结果与试剂说明书中提到的中国临床机构3321例新生儿做出的参考区间进行比对，发现大部分氨基酸和肉碱参考区间具有一致性，而VAL、ARG、MET、PRO差异较大，提示需要建立本地区新生儿氨基酸和肉碱参考区间，以来提高遗传代谢病筛查可靠性。

另外本研究得出的参考区间与甘肃地区参考区间比较[8]，两地区11种氨基酸的参考区间差别较大，除TYR、MET外其余9种氨基酸甘肃地区的参考区间较河南地区的参考范围广；除C0、C2外其余29种酰基肉碱的参考区间差别较小。甘肃地区和河南地区同样采取P0.5～P99.5界定参考区间，不同地区的参考区间差异较大，这可能与地域和饮食习惯有关，也可能与地区温度和湿度相关。有研究表明，低温低湿储存和冷链递送方式可以有效减缓干血斑标本中部分氨基酸和肉碱的降解速度,提高串联质谱检测结果的准确性和可靠性[15]。此外，母亲饮食及营养状况、激素水平和新生儿成熟度 、孕周、出生体重、分娩方式和出生季节等也可影响氨基酸和酰基肉碱的参考区间[16-17]。除此之外，检测人员对实验掌握的熟练程度也会影响参考区间的建立，因此，每个实验室都应该建立自己的参考区间。如果有必要，可以在后续筛查中按照性别、出生体重等分类设定特定项目的参考区间。综合来说，

本文以较大样本建立了河南省健康新生儿氨基酸及酰基肉碱参考区间，为患儿就诊时排除或辅助诊断遗传代谢疾病提供稳定可靠的检验指标，可能为本地区新生儿遗传代谢病的筛查提供数据参考。