补肾健脾-利湿化瘀方对IgA肾病模型大鼠Tfh细胞通路影响的研究

王银萍，张洪宝，邹 迪，张守琳

（长春中医药大学附属医院，长春 130021）

补肾健脾-利湿化瘀方由已故国医大师任继学教授提出，用于治疗慢性肾风（IgA肾病），可有效降低IgA肾病患者尿中红细胞计数及尿蛋白含量，有效延缓肾功能恶化。为进一步研究补肾健脾-利湿化瘀方治疗IgA肾病的作用靶点，课题组开展了此项研究。

1 主要材料

1.1 实验动物

8周龄雄性清洁级SD大鼠90只，体质量180～200 g，购于北京维通利华实验动物有限公司[SCXK（京）2016-0006]。

1.2 实验药物

补肾健脾-利湿化瘀方药物组成：生地黄20 g，生黄芪20 g，黄芩15 g，穿山龙30 g，土茯苓20 g，山药20 g，生茅根20 g，生蒲黄15 g（包煎），茯苓30 g，葛根15 g，紫荆皮15 g。由长春中医药大学药学院提供浓缩剂。洛汀新片（盐酸贝那普利片）每片10 mg，国药准字H20030514。

1.3 实验主要试剂

ICOS Monoclonal Antibody（mA-6E1），FITC，eBioscience，11-4204-81；CXCR5 Monoclonal Antibody（LG.7F9），PE，eBioscience，12-0271-82；兔抗Bcl-6，Bioswamp，PAB30215；兔抗IL-21抗体，Bioswamp，PAB33379。

2 实验方法

2.1 造模方法及分组给药方法

购买健康清洁级SD大鼠90只，喂养1周后随机分为空白组、模型组、洛汀新组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组15只，采用陆慧瑜[1]改良造模法进行模型制备。造模后第9周末，从各组中随机各抽取2只，处死后，腹部解剖，分离出肾组织，标本制作，荧光染色，最后在免疫荧光下判断肾小球系膜区是否有免疫球蛋白IgA的沉积，如果有沉积，则判断为模型制备成功。

验证模型成功后，开始药物干预，不同的组别用药则不同，其药物用量标准参照按体质量系数进行计算。其中中药高剂量组含有中草药37.42 g，中剂量组含有中草药18.71 g，低剂量组含有中草药9.35 g，洛汀新组含洛汀新片63 mg· kg-1；模型组及空白组无需给药，给予等量的生理盐水。药物干预观察到第16周末。

2.2 检测指标及方法

观察各组的一般状态，16周后处死，立即取肾脏、小肠黏膜。新鲜的小肠黏膜表达的ICOS、CXCR5采用流式技术进行检测；小肠黏膜表达的Bcl-6、IL-21采用免疫组化法进行检测；采用电镜法观察大鼠肾脏病理的改变。

2.3 统计学方法

实验数据将采用SPSS 23.0统计方法进行处理，计数资料采用均数±标准差（±s） ，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有显著统计学意义。

3 实验结果

3.1 一般情况

从模型制备到药物干预结束，共14只大鼠死亡，其中在造模过程中模型组及高剂量组各死亡1只，原因为造模后大鼠进食差而死亡；其余12只为每组中各取出的2只，主要用于模型炎症。在整个实验过程中，空白组大鼠精神状态良好，食欲强，体质量也逐渐增加；其他各组大鼠从造模后的第4周开始，毛发逐渐枯燥，食欲逐渐减退，精神逐渐变差，体质量逐渐减轻；从用药干预7周后，与模型组比较，各治疗组大鼠一般状态逐渐好转，精神逐渐恢复，体质量逐渐增长，但仍不如空白组精神状态好。

3.2 各组ICOS在小肠黏膜的表达

在空白组中，小肠黏膜及骨髓中ICOS表达均较少，在模型组中，ICOS表达均呈强阳性；给药后，治疗组各组ICOS表达均减少，以中药中剂量组减少最显著。见图1。

3.3 各组CXCR5在小肠黏膜的表达

空白组中，小肠黏膜中CXCR5表达呈微弱表达；模型组中，CXCR5表达明显增强；给药后，各治疗组CXCR5表达均减少，以中药中剂量组减少最显著（P＜0.05）。见图2。

图2 各组CXCR5在小肠黏膜的表达

3.4 各组Bcl-6在小肠黏膜的表达

在空白组中，小肠黏膜Bcl-6表达较少，呈浅黄色散在分布；在模型组中，Bcl-6表达明显增多，呈颗粒状阳性深棕色表达，阳性细胞数量明显增加（P＜0.01）；给药后，各治疗组小肠黏膜Bcl-6表达明显减少，中药中剂量组减少更为明显（P＜0.01）。见表1、图3。

表1 各组Bcl-6在小肠黏膜的表达比较（±s）

表1 各组Bcl-6在小肠黏膜的表达比较（±s）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与其他治疗组比较，▲▲P＜0.01

组别 例数 平均值 标准差 F P空白组 13 0.205 0.027 126.447 0.000模型组 12 0.530## 0.033洛丁新组 13 0.345△△ 0.039中药高剂量组 12 0.320△△ 0.026中药中剂量组 13 0.270△△▲▲ 0.031中药低剂量组 13 0.307△△ 0.029

图3 各组Bcl-6在小肠黏膜的表达

3.5 各组IL-21在小肠黏膜的表达

空白组中IL-21在小肠黏膜的表达较少，呈浅黄色表达；模型组中IL-21表达呈强阳性（P＜0.05）；给药后，各治疗组IL-21的表达均明显减少，中药中剂量组减少更为明显（P＜0.05）。见表2、图4。

表2 各组IL-21在小肠黏膜的表达比较（±s）

表2 各组IL-21在小肠黏膜的表达比较（±s）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与其他治疗组比较，▲▲P＜0.01

组别 例数 平均值 标准差 F P空白组 13 0.225 0.029 52.180 0.000模型组 12 0.490## 0.037洛丁新组 13 0.337△△ 0.050中药高剂量组 12 0.321△△ 0.051中药中剂量组 13 0.275△△▲▲ 0.031中药低剂量组 13 0.311△△ 0.037

图4 各组IL-21在小肠黏膜的表达

3.6 各组肾脏电镜的改变

空白组中肾小球系膜区无系膜细胞及内皮细胞增生，未见电子致密物沉积，足细胞正常；模型组中肾小球系膜区可见大量电子致密物的沉积，少数系膜细胞增生，足细胞广泛融合；其他各治疗组显示肾小球系膜区电子致密物呈不同程度的减少，足细胞部分恢复，系膜细胞及内皮细胞增生减少，但中药中剂量组肾脏系膜区仅表现为少量电子致密物，足细胞基本恢复正常。见图5。

图5 各组肾脏电镜的改变

4 结论

基于现代医学研究，IgA肾病多与肠道黏膜感染有关[2-4]。在前期工作中已证实补肾健脾-利湿化瘀方可通过调节血清及小肠黏膜中Th1/Th2失衡起到治疗IgA肾病的作用，同时课题组发现小肠黏膜T、B淋巴细胞免疫系统中滤泡辅助性T细胞通络相关的细胞因子参与IgA肾病的发病，此发病机理与任继学教授提出的“脾肾亏虚、肠道湿热瘀阻”相吻合。基于此，课题组开展了此项研究，本研究结果表明：1）与空白组比较，模型组大鼠的Tfh相关细胞分化的关键因子Bcl-6、CXCR5及ICOS、IL-21在小肠黏膜的表达明显升高（P＜0.05），表明小肠黏膜生发中心T细胞向Tfh细胞的分化被加强，促使B细胞向分泌IgA的浆细胞分化，诱导B淋巴细胞提前分化，增加糖基化异常的IgA含量，并沉积于肾脏，肾脏病理表现为肾小球系膜区可见大量电子致密物沉积，系膜细胞增生，足细胞广泛融合，即导致IgA肾病；2）治疗后，各治疗组与模型组比较，小肠黏膜Bcl-6、CXCR5及ICOS、 IL-21的表达明显减弱，且肾脏病理表现为肾小球系膜区电子致密物呈不同程度的减少，足细胞部分恢复，内皮细胞增生减轻，其中中药中剂量组减弱更为显著（P＜0.05）。由此可见，补肾健脾-利湿化瘀方可以通过抑制小肠黏膜生发中心Tfh的过度活化，减少其相关因子Bcl-6、CXCR5及ICOS、 IL-21的表达，减少小肠黏膜生发中心的B细胞转化为IgA+B细胞，进而减少糖基化异常的IgA的产生，从而缓解肾脏损伤，为临床治疗提供了实验依据。