ZEB1基因在甲状腺乳头状癌诊断中的意义及对细胞上皮-间质转化的影响

柳家荣 张 琪

甲状腺乳头状癌是女性比较多见的头颈部肿瘤，常见的病因主要与碘缺乏、内分泌紊乱和精神压力大等有关[1-2]，临床症状常见甲状腺滤泡增生、甲状腺组织肿大，如若出现肿瘤近期迅速增大或者瘤体活动受限或固定等情况，甲状腺腺瘤则可能发生癌变，应及时治疗。EMT是发育过程中细胞的生理性重编程现象，但近年研究表明EMT与肿瘤的发生、发展密切相关[3]。由于EMT的发生，细胞迁移能力和增殖能力增强，促进了肿瘤细胞的快速发生和发展[4]。ZEB1是位于10号染色体的一种进化相对保守的转录因子，属于锌指同源结构域转录因子。据报道，ZEB1在甲状腺癌中有明显的表达，且基因上调或者下调影响癌细胞的生长或凋亡[5]。本实验旨在探讨ZEB1基因在甲状腺乳头状癌诊断中的意义及对细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取90例2018年4月到2020年7月到我院进行治疗的甲状腺乳头状癌患者，作为甲状腺乳头状癌组，其中男性45例、女性45例，年龄21～59岁，临床病理分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期18例、Ⅲ期33例、Ⅳ期27例。另外选取同期到我院进行体检的健康者90例作为正常对照组，其中男性48例，女性42例，年龄20～60岁。2组性别、年龄比较，统计学差异不显著(P>0.05)。

1.2 细胞与试剂

甲状腺乳头状癌细胞TPC-1购自美国公司；FBS购自日本Sanyo公司；DMEM培养基购自美国HyClone公司；qPCR试剂盒均购自武汉博士德生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒、SDS-PAGE试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所；Transwell小室购自美国BD公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血液样本采集 对所有受试者(清晨空腹)采集肘静脉血液5 mL，在低温高速离心机中，每分钟3000转，离心10 min，提取上清液，-20℃保存备用。

1.3.2 细胞培养与分组 用含10%FBS的DMEM培养基培养甲状腺乳头状癌细胞TPC-1，待细胞融合度达到90%左右时，消化传代，取对数生长期细胞进行实验。正常培养TPC-1作为Con组；将siRNA-Con、siRNA-ZEB1转染进入TPC-1，作为siRNA-Con组和siRNA-ZEB1组，培养48 h，进行后续实验。

1.3.3 qPCR检测ZEB1基因表达 收集各组细胞，采用RNA提取试剂提取细胞总RNA，反转录试剂盒将RNA合成cDNA，荧光定量PCR试剂盒进行PCR。采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.3.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭 收集200 μL的细胞接种于Transwell小室上层，培养24 h后，吸去培养液，用PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，30 min后，用0.1%结晶紫染色，10 min后，计数发生迁移的细胞数量。细胞侵袭实验，在Transwell小室上层加入50 μL基质胶Matrigel，凝固后接种细胞，之后实验步骤同细胞迁移一样。

1.3.5 Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达 RIPA蛋白裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。取样品蛋白50 μg上样，用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，将蛋白条带转移至PVDF膜。室温封闭1 h，加入一抗(1∶1000稀释)，4℃孵育过夜；加入二抗(1∶2000稀释)，室温孵育2 h，在暗室中曝光显影，用Quantity One凝胶分析软件处理，检测蛋白条带的灰度值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 甲状腺乳头状癌组织中ZEB1基因的表达

与正常对照组ZEB1基因水平(1.01±0.08)相比，甲状腺乳头状癌组ZEB1基因水平(3.42±0.58)显著升高(t=28.019，P<0.05)。

2.2 ZEB1基因与甲状腺乳头状癌临床病理参数的关系

以90例甲状腺乳头状癌患者ZEB1基因水平平均值为界，<平均值为低表达，≥平均值为高表达。90例中ZEB1基因低表达35例，高表达55例。

ZEB1基因表达与临床分期、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移密切相关(P<0.05)；ZEB1基因表达与年龄无关(P>0.05)。见表1。

表1 ZEB1基因与甲状腺乳头状癌临床病理参数的关系

2.3 ZEB1基因表达对甲状腺乳头状癌的诊断价值

血清ZEB1基因表达对甲状腺乳头状癌的诊断价值，灵敏度为90.20%，特异度为93.88%，AUC曲线下面积为0.945，标准差为0.0217，95%CI为：0.881～0.981，Z统计为20.483，P<0.0001。见图1。

图1 价值诊断图

2.4 抑制ZEB1表达对甲状腺乳头状癌细胞迁移和侵袭的影响

与Con、siRNA-Con组相比，siRNA-ZEB1组ZEB1 mRNA表达水平以及细胞迁移数、细胞侵袭数显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 抑制ZEB1表达对甲状腺乳头状癌细胞迁移和侵袭的影响

2.5 抑制ZEB1表达对甲状腺乳头状癌细胞EMT的影响

与Con、siRNA-Con组相比，siRNA-ZEB1组N-cadherin蛋白表达明显下调(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.05)。见图2，表3。

图2 相关蛋白图

表3 抑制ZEB1表达对甲状腺乳头状癌细胞EMT的影响

2.6 抑制ZEB1表达对MAPK信号通路相关蛋白的影响

与Con、siRNA-Con组相比，siRNA-ZEB1组ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图3，表4。

表4 抑制ZEB1表达对MAPK信号通路相关蛋白的影响

图3 相关蛋白图

3 讨论

甲状腺癌主要分为滤泡上皮细胞起源的乳头状癌、滤泡状癌和未分化癌，以及来源于滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌[6-7]，本论文主要对甲状腺乳头状癌进行了一系列研究。

本实验研究表明，与正常对照组相比，甲状腺乳头状癌组ZEB1基因表达水平显著升高。抑制ZEB1 mRNA表达，显著降低甲状腺乳头状癌细胞迁移数、细胞侵袭数和EMT相关蛋白表达。已有研究结果与本实验一致。李思[8]研究表明，在转录后水平上调ZEB1的表达，导致甲状腺癌细胞发生EMT，促进癌细胞侵袭、转移。还有类似的研究表明，沉默FOXQ1基因可逆转TPC-1细胞的EMT和侵袭迁移能力[9]。沉默TFF3可以降低甲状腺乳头状癌细胞TPC-1细胞株迁移能力、侵袭能力、克隆形成能力[10]。

本实验研究发现，血清ZEB1基因表达对甲状腺乳头状癌的诊断价值，灵敏度为90.20%，特异度为93.88%，AUC曲线下面积为0.945。研究表明PDK1,ZEB1和Vimentin联合评估可能对甲状腺乳头状癌的预后判断具有重要作用[11]。已有文献发表，贾勐等[12]研究结果显示血浆cfDNA对甲状腺肿瘤诊断的灵敏度为95.0%、特异性为94.0%、准确率为95.0%，表明cfDNA有助于恶性甲状腺肿瘤的诊断。林恩德等[13]研究结果显示， 单基因检测BRAF突变在<1 cm结节中比FNAC有更好的诊断能力，是甲状腺微小乳头状癌一个可靠的诊断指标。

E-cadherin是一种肿瘤抑制蛋白，E-cadherin表达下降，N-cadherin表达上升是细胞发生EMT过程中最有代表性的分子特征[14-15]。本实验发现，抑制ZEB1 mRNA表达，显著降低细胞N-cadherin蛋白表达，显著升高细胞E-cadherin蛋白表达。李艳等[16]研究发现，敲低信号转导子和转录激活子5(Stat5)抑制甲状腺癌细胞EMT。薛云等[17]研究发现，甲状腺癌组织中Stat5高表达，且Stat5参与了甲状腺癌的EMT过程。杨春伟等[18]研究发现，甲状腺癌组织中存在EMT。

MAPK/ERK通路与肿瘤细胞的增殖和凋亡关系密切，并且参与了EMT的发生和发展，具有极其重要的作用[19-20]。本实验结果显示，抑制ZEB1 mRNA表达，可显著降低ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表达。而孙国欣等[21]文献报道，甲状腺癌与MAPK信号通路有密切的联系。

综上所述，ZEB1基因表达对甲状腺乳头状癌具有较高的诊断价值，抑制ZEB1基因能通过MAPK信号通路降低细胞迁移、侵袭能力，抑制上皮间质转化。