麻醉用药七氟烷对发育神经毒性机制的网络药理学研究

李海龙

抚顺市第二医院(辽宁 抚顺 113000)

七氟醚是一种芳香、无刺激的无色透明液体，化学性质相对稳定，与钠石灰反应生成五种物质，易于被小儿患者接受。优点有：麻醉诱导快、维持麻醉平稳、易于调节麻醉深度、苏醒快、保护心肌等[1]。因此，近年来七氟醚被众多麻醉学者所钟爱，称其为吸入麻醉药物的里程碑，七氟醚的麻醉诱导以及麻醉维持在小儿麻醉领域更是具有多种显著优势。但有研究表明，七氟醚对发育期中枢神经系统有一定毒性作用，可引起神经发育障碍[2]。儿童早期接触七氟醚可增加青春期学习障碍的发生率[3]。关于七氟烷麻醉药引起的发育神经毒性的机制目前虽有学者基于不同模型进行研究，但还不是十分清楚透彻。

网络药理学是融合系统生物学、多向药理学、网络分析及计算机技术，通过“药物-靶标-基因-疾病”相互作用网络的分析，探索药物与疾病之间的关联[4]。通过疾病-基因-靶点-药物相互作用网络，可以将单个靶点或多个靶点在整个生物网络进行定位，加速药物靶点的发现，进而分析药物对疾病网络的干预与影响，使研究者可以全面地了解疾病病理基础与药物治疗作用。

为进一步阐明七氟烷麻醉药引起的发育神经毒性的机制，本研究运用网络药理学的研究方法，运用Drugbank、GeneCards数据库检索七氟烷及发育神经毒性的相关靶点,构建“药物-靶点-基因-疾病”模型及互作网络，并对其交集靶点进行生物信息学分析，阐明其可能的作用机制，为后续实验及临床提供研究基础及思路。

1 研究方法

1.1 获取七氟烷的药物靶点

使用DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)检索七氟烷(sevoflurane)并提取相关的靶点基因。

1.2 检索发育神经毒性靶点基因

使用Gene Cards(The Human Gene Database,https：//www.geneca-rds.org/)，检索“development Neurotoxic”，通过“export to excel”输出Excel表格，并查找出七氟烷与发育神经毒性的靶点基因交集，绘制韦恩图。

1.3 氟烷-靶点网络和PPI网络构建

将七氟烷靶点相关信息导入Cytoscape_v3.7.1软件，绘制七氟烷靶点网络；使用STRING平台(STRING version:10.5https：//string-db.org/)构建蛋白互作网络(protein-protein interaction network,PPI network)。打开STRING页面，选择“Multiple proteins”，将上面1.2得到在靶点基因复制到“List Of Names”中，“Organism”中选择“Homo sapiens”，其余参数保持默认状态，以此可构建这些潜在靶点之间的蛋白作用关系网络图。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析

使用R语言软件对七氟烷与发育神经毒性的共同作靶点进行ID转换；在R语言中调用bioconductor程序包进行数据的处理；运行R语言分别得到GO和KEGG富集分析的条形图、气泡图、通路图；使用Perl将转换的ID变成原始基因靶点。

1.5 相关软件

R语言Rx64 3.5.3及VennDiagram包、count.R包，clusterProfiler包、org.Hs.eg.db包、symbol2id包，UltraEdit，Java1.8.0_201-b09，“Perl”addSymbol.pl脚本，Cytoscape_v3.7.1。

2 结果分析

2.1 七氟烷药物相关靶点

经过检索DrugBank数据库，提取到七氟烷22个相关靶点，如表1所示。

表1 七氟烷药物相关靶点

2.2 发育神经毒性相关靶点

在Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)以“development Neurotoxic”为检索词查找发育神经毒性靶点信息，共得到靶点1157个。将七氟烷靶点与发育神经毒性靶点信息进行比对并取交集，共得到靶点11个，即为七氟烷致发育神经毒性的潜在作用靶点。如图1所示。

图1 七氟烷致发育神经毒性的潜在作用靶点

2.3 七氟烷-靶点网络和PPI网络

将映射后的交集靶基因与七氟烷，采用Cytoscape-v3.7.1软件可视化分析，得到“七氟烷-靶点-发育神经毒性”网络图，如图2所示。此网络共包括节点13个，其中11个节代表靶点，1个节点代表七氟烷，1个节点代表发育神经毒性，共有边21条。粉色V形节点代表七氟烷致发育神经毒性的候选靶点，红色六角形节点代表发育神经毒性，蓝色矩形代表七氟烷。边代表七氟烷与靶点的关系及发育神经毒性与靶点的关系。由图可知，七氟烷致发育神经毒性多靶标的特点。将交集得到的靶点运用STRING数据库获得蛋白-蛋白相互作用数据，选取置信度得分>0.7的数据，构建七氟烷致发育神经毒性作用靶点PPI网络图，结果如图3所示。

图2 “七氟烷-靶点-发育神经毒性”网络图

图3 七氟烷致发育神经毒性靶点PPI

2.4 GO富集分析

对11个交集靶基因，采用R语言symbol2id包，定义log2FC为1，在“org.Hs.eg.db”数据库中搜索，将gene name转化为geneID，得到输入文件，如表2所示。

表2 七氟烷发育神经毒性作用靶点ID转化

采用R语言bioconductor包、clusterProfiler包及id2symbol.pl脚本，在GO数据库中检索，fisher精确检验，pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05。

GO功能(细胞组分、分子功能、生物学过程)富集分析，共获得具有显著意义的条目共35条，根据校正的P值排序，取排名前20的路径，如图4所示。富集越多显著颜色越偏红色，富集越少颜色越偏蓝色；横坐标表示富集数目，纵坐标表示涉及到的功能。结果表明，靶标基因主要涉及的分子生物学功能为GABA-A receptor activity(GABA-A受体活性)、transmitter-gated ion channel activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential(参与传递离子通道活性的突触后膜电位的调节)、neurotransmitter receptor activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential(神经递质受体活动参与突触后膜电位的调节)、GABA receptor activity(GABA 受体活性)、transmitter-gated ion channel activity(传送门控离子通道活性)、inhibitory extracellular ligand-gated ion channel activity(抑制细胞外配体门控离子通道活性)、ligand-gated anion channel activity(配体门控阴离子通道活性)、benzodiazepine receptor activity(苯二氮受体活性)、neurotransmitter receptor activity(神经递质受体的活性)等。

图4 靶标基因GO富集分析top20

2.5 KEGG富集分析

采用R语言bioconductor包、clusterProfiler包及id2symbol.pl脚本，在KEGG数据库中检索，fisher精确检验，pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05。KEGG通路富集分析，共富集具有显著意义7条信号通路，根据校正的P值排序，如图5所示。七氟烷对发育神经毒性的与Nicotine addiction(尼古丁成瘾)、Retrograde endocannabinoid signaling(逆行内源性大麻素信号传导)、GABAergic synapse(GABA能突触)、Morphine addiction(吗啡成瘾)、Neuroactive ligand-receptor interaction(神经活性配体受体相互作用)、Taste transduction(味觉传导)、Serotonergic synapse(5-羟色胺能突触)有关。

图5 靶标基因KEGG富集分析

3 讨论

网络药理学由Andrew L Hopkins在2007年首次提出[5]，它是在系统生物学、计算生物学、网络生物学、分子药理学、多向药理学等学科基础上发展起来的，运用网络分析手段，从整体水平出发，构建“药物-靶点-疾病”等分析网络，探索药物、靶点、机体相互作用关系，具有系统性、整体性。

近年来，越来越多的数据表明七氟烷麻醉可能对神经具有潜在的毒性从而会引发各种临床并发症，其中较为常见的有术后认知功能障碍、神经发育损伤等。本研究对七氟烷与发育神经毒性进行分析，在信号通路富集结果中Retrograde endocannabinoid signaling通路是最值得我们关注的。有研究表明，七氟烷可能通过激活PI3K/Akt信号通路增加Cx43蛋白表达，并诱导海马神经元凋亡，增加幼鼠认知功能损伤[6]。进一步通过磷酸化蛋白质组学技术，发现GSK3β,p44/p42-MAPK以及MAPK2磷酸化水平和异氟烷及七氟烷介导的神经毒性有关，之后有学者也通过分子生物学实验进行了验证[7]。通过KEGG的Retrograde endocannabinoid signaling信号通路图(图5)，我们可以看出在通路中，MAPK信号通路起核心调控作用，七氟烷麻醉时对发育神经的影响，可能是通过激活MAPK信号通路，进而影响其上下游通路，如PI3K/Akt信号通路。通过KEGG富集结果可知，在Retrograde endocannabinoid signaling中，富集的重要的靶基因有GABRA1、GRIA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB2、GABRB3、GABRE。关于这些靶点及信号通路在今后的研究中还需要进一步通过动物模型实验和细胞生物学实验进行验证，本研究可为科研实验提供了新思路。