大白猪繁殖性状全基因组关联分析

2022-08-13周佳伟吴俊静李梓芃彭先文梅书棋

中国畜牧杂志 2022年8期

张宇，周佳伟，吴俊静，乔木，徐忠，李梓芃，彭先文，梅书棋

（动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉 430064）

生猪养殖业是我国农业生产发展的重要支柱产业，国家统计局数据显示2021 年度我国生猪存栏44 922 万头，出栏生猪67 128 万头，猪肉产量5 296 万t，生猪饲养量和猪肉产量均居世界第一，占世界总量的50%以上。在生猪养殖和生产中，母猪繁殖能力的高低直接影响猪场的生产和经济效益。然而由于繁殖力属于低遗传力性状，其遗传力在0.06～0.30 之间，因此常规的育种工作很难有效提高繁殖性状的遗传进展。

随着分子生物学的发展，一批与繁殖性状相关的重要功能基因，包括雌激素受体基因（ESR），卵泡生成素基因（FSHB）等在育种工作中广泛应用，有效提高了繁殖性状的遗传进展。因此，进一步挖掘繁殖性能相关的分子标记和候选基因，并利用标记辅助选择和基因组选择技术，能够有效提升繁殖性状等低遗传力性状的选育进展。

基于高通量测序或者SNP 芯片的全基因组关联分析（Genome-wide Association Study，GWAS）已经成为畜禽重要经济性状候选基因挖掘的主要方法。例如，在清平猪的研究中，针对乳头数性状进行GWAS 分析，挖掘到包括14 号染色体QTL 区域在内的一系列候选基因和分子标记。对于大白猪的研究中针对产仔数性状进行GWAS 分析，分别鉴定出1 号染色体、7 号染色体和18 号染色体上多个QTL 区域并确定和为繁殖性能的候选基因。

本研究收集1 100 头大白猪繁殖群体，记录总产仔数（Total Number Born，TNB）、产活仔数（Number Born Alive，NBA）和健仔数（Number Healthy Piglet，NHP）进行GWAS 分析，鉴定与繁殖性状相关的SNPs及候选基因，为后续通过分子育种手段进一步加快繁殖性能的选育提供分子标记并奠定遗传基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和样品采集本研究中1 100 头纯种大白猪群体来自于贵州某商品猪育种场，采集群体耳尾组织，并记录繁殖性状和相关信息，包括TNB、NBA、NHP、与配公猪、分娩日期等。

1.2 “中芯一号”芯片基因分型利用动物组织DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP304）提取群体样品耳尾组织的基因组DNA，将质检合格的DNA 样品利用“中芯一号”芯片进行基因分型。利用PLINK v1.9 软件对基因型数据进行质量控制，剔除检出率<90%、最小等位基因频率（MAF）<0.05 以及哈代-温伯格平衡<1×10的SNPs，剔除基因型缺失率>10%的个体。

1.3 群体结构分析为了确定样本群体是否存在分层现象，本研究利用PLINK v1.9 软件对有效SNPs 进行主成分分析（PCA），获得基因组数据特征值和特征向量，并利用MEGA X 软件进行邻接树分析，绘制个体间的遗传距离图谱。

1.4 统计分析本研究采用rMVP 软件进行关联分析。rMVP 是一个用于GWAS 分析的经典软件，利用软件中的混合线性模型（MLM）方法，将与配公猪效应作为固定效应加入关联分析模型中，本实验采用的关联分析模型如下：

其中，为对应的繁殖性状表型值包括总TNB、NBA和NHP；表示效应矩阵；表示固定效应向量，包括前3 个主成分和与配公猪效应；表示SNPs 标记分型向量；表示SNPs 标记效应向量；是随机效应，为的相关矩阵；表示残差；其中服从正态分布N（0，K），表示SNPs 标记解释的加性遗传方差；K 表示亲缘关系矩阵。本研究采用 Bonferroni 多重检验方法确定关联显性阈值，基因组水平显著阈值为0.05/有效 SNPs 位点数量，染色体水平显著阈值为1/ 有效SNP s 位点数量。

1.5 候选基因注释利用ENSEMBL（http://ftp.ensembl.org/pub/release-89/）数据库，对GWAS 分析中显著的SNPs 位点，在其上下游200 kb 区域进行注释，并结合文献挖掘繁殖性状相关候选基因。

2 结果

2.1 表型数据分析对1 100 头大白猪的头胎产仔数进行统计，TNB 平均为13.13 头，NBA 数平均为12.84 头，NHP 平均为12.10 头。考虑到与配公猪可能对繁殖性能产生影响，通过广义线性模型对TNB、NBA 和NHP分别进行分析，结果表明不同的与配公猪对产仔数性状具有显著影响（表1），因此在GWAS 分析过程中需要将与配公猪作为固定效应，以提高关联分析的准确性。

表1 与配公猪对大白猪繁殖性状的影响

2.2 群体结构分析利用PLINK 将“中芯一号”芯片检测数据进行过滤，共得到1 100 个有效个体及41 241个有效SNPs 位点，用于后续分析。通过主成分分析，绘制基于前2 个特征向量的主成分结构图（图1），结果表明群体结构稳定，仅有少数个体表现出群体分层，因此须在关联分析模型中加入相应主成分进行矫正，以减少关联分析的假阳性。根据SNPs 位点计算遗传距离，利用MEGA X 绘制群体邻接树（图2），结果表明群体分支与系谱关系高度一致，可用于后续的关联分析。

图1 群体主成分分析图

图2 群体结构NJ-Tree 图

2.3 GWAS 分析采用rMVP 软件分别对TNB、NBA和NHP 进行GWAS 分析，检测影响繁殖性能的显著SNPs 位点，基因组水平显著的阈值为1.21×10，染色体显著水平为2.42×10，见图3。结果表明，对于TNB 性状，共有3 个显著的标记，分别位于3 号染色体10 004 418 bp、13 号染色体88 261 322 bp 和13 号染色体8 889 672 bp。对于NBA，显著的标记共有4 个，分别位于13 号染色体和X 染色体上，其中13 号染色体上有2 个位点与TNB 位点相同，另一位点位于84 631 745 bp处，X 染色体上的显著位点位于7 643 578 bp 处。NHP相关的SNPs 共有18 个，其中1 号染色体上1 个，位于16 919 223 bp 处，其余均位于13 号染色体上，集中在84.5～85.6 Mb 之间。QQ 图也表明模型拟合程度较好，3 个产仔数相关性状均有显著SNPs 位点呈现显著关联。

图3 繁殖性状GWAS 分析曼哈顿图和QQ 图

进一步对上述显著位点上下游200 kb 的区域内挖掘繁殖性状相关候选基因，结果如表2 所示。可见，1 号染色体上与NHP 有关的位点附近包含基因；3 号染色体上与TNB 有关的位点附近包含基因；13 号染色体上与繁殖性状相关的区域包含等17 个候选基因。以上基因中等基因均被报道与繁殖性状相关。

表2 繁殖性状全基因组关联分析显著位点信息

3 讨论

繁殖性能是养猪业重要的经济性状，为了提升母猪繁殖性能，挖掘繁殖性状相关候选基因和分子标记，本研究收集1 100 头纯种大白猪的繁殖记录，利用“中芯一号”芯片进行基因分型，并分别对总TNB、NBA 和NHP 性状进行全基因组关联分析。

通过对繁殖性状和相关数据的统计分析，1 100 窝母猪的与配公猪共计19 头，广义线性模型和邓肯多重比较的结果表明，不同与配公猪的繁殖性状存在显著差异，以TNB 性状为例，与配公猪Y206402 相关的窝中，TNB 均值仅为10.45 头，低于群体均值13.13 头，因此GWAS 分析模型中考虑将与配公猪作为固定效应。通过对群体进行PCA 分析，结果表明少数个体存在分层，结合系谱信息和邻接树信息发现分层个体与血统相关，因此为了提高GWAS 分析的准确性，考虑将前3 个主成分作为固定效应加入关联分析模型中。

通过关联分析，鉴别到包括在内的6个繁殖性状相关候选基因，其中编码雌激素受体基因1，是猪产仔数的主效基因之一，大量研究表明基因与不同品种猪的繁殖性状相关。基因是编码猪透明带的一种重要的硫酸化糖蛋白，在精卵识别和结合的过程中发挥重要的作用，在猪中的相关研究表明ZP3 与透明带粘粘蛋白的结合具有重要的生物学意义，关联分析结果也表明，该基因与繁殖性状相关。基因全称酪氨酸3 单加氧酶/色氨酸5 单加氧酶激活蛋白、肽，与癫痫等疾病相关，有报道指出，在该基因在猪卵巢从卵泡期到黄体期的发育过程中发挥重要作用，因此可能是母猪卵巢发育相关的重要分子标记。编码热休克27 kDa 蛋白1，主要参与细胞凋亡等多种免疫过程，研究表明初生时体重较轻的仔猪该基因表达量低于同窝较重的仔猪，因此基因可能与初生重性状相关，可作为繁殖性状的候选基因之一。基因编码苹果酸脱氢酶2，在大量动物的研究中表明在可育精子中均呈现出较高的表达水平，可能是生育能力的重要生物标记。基因编码丙酰辅酶A 羧化酶的肽，大量报道与丙酸血症有关，在牛的繁殖性状相关研究中发现该基因与牛的妊娠率和生育率都有显著的关联，因此基因也可能作为繁殖性状的分子标记。

此外，基因编码视黄醇结合蛋白1，是维生素A 代谢和维甲酸转运的细胞内调节因子，在针对非洲爪蟾的研究中发现该基因对神经组织的发育至关重要，本研究发现该基因与NHP 性状有关。基因编码基质抗原1，参与细胞周期、细胞分裂等多种生物学过程，研究表明与该基因同一家族的基因与人类的原发性卵巢功能不全有关，本研究结果表明基因可能与NBA 和NHP 有关，因此可能作为潜在的繁殖性状相关候选基因。