有机物料与土壤质地对土壤球囊霉素的影响

温云杰，刁风伟，高 敏，王秀红，史向远

（山西农业大学山西有机旱作农业研究院/省部共建有机旱作农业国家重点实验室（筹）/有机旱作农业山西省重点实验室，山西 太原 030031）

土壤球囊霉素（glomalin-related soil protein）是 由丛枝菌根（AM）真菌分泌的一种耐热糖蛋白类物质，在陆地生态系统中广泛存在，是土壤中重要的有机碳库，并且具有促进土壤颗粒团聚、增加土壤团聚体稳定性、改善土壤结构的作用[1]。最近有研究发现，球囊霉素可以与重金属元素结合，降低重金属元素的活性。可见，球囊霉素对缓解土壤退化、维持土壤生态系统的稳定具有重要作用[2]。

球囊霉素的含量与丛枝菌根真菌宿主的植物类型以及根际环境密切相关，并且受耕作制度、施肥方式等因素的影响[3]。不同的耕作制度会改变土壤环境，进而影响土壤微生物的群落结构和活性，最终影响土壤中球囊霉素的含量。与传统性耕作相比，免耕和少耕的耕作制度能够显著提高土壤球囊霉素的含量，这主要是因为长期耕作会破坏丛枝菌根真菌侵入植物根系的能力。相关研究发现[4]，随着免耕年限的增加，球囊霉素含量的增加幅度逐渐减小，且球囊霉素含量随着土壤深度的增加而下降，可能是因为长期免耕会降低土壤中CO2含量，抑制丛枝菌根真菌的生长，最终降低球囊霉素的含量。杜介方等[5]研究发现，与不施肥、单施化肥的施肥方式相比，有机-无机肥配合施用可显著提高球囊霉素的含量，且提升效果与施用有机肥的种类密切相关。可见，合理的耕作和施肥方式可以提升土壤肥力、增加微生物丰度和活性，进而提高土壤球囊霉素的含量[6]。

土壤质地即土壤的机械组成（黏粒、粉粒、砂粒含量），对土壤的物理性质（结构性、热量、通气性、水分运移、耕性等）、化学性质（吸附性能、氧化还原性能等）、微生物（生物多样性、酶活性等）均有重要的影响，并控制着有机物的降解和土壤有机质的形成[7]，是土壤肥力的物质基础。与砂质土壤相比，黏粒较高的土壤可以形成良好的团聚体结构，固定更多的有机碳，有利于微生物的生长繁殖，并提高有机物的降解速率。并且有研究认为，土壤质地对细菌的影响更为显著[8]。但是，土壤黏粒过高会造成土壤板结紧实，有机质减少，阻碍微生物的定殖。可见，土壤质地可以通过影响有机质的累积、微生物的群落结构和活性等，进而影响土壤球囊霉素的含量。准确地认识土壤质地对土壤球囊霉素的影响机制，对于有机肥的合理施用、土壤肥力的提升等方面具有重要意义。目前，有机物料与土壤质地对球囊霉素的影响缺少更系统的研究。

本研究分别选择3 种不同质地的土壤和有机物料，通过培养试验，研究有机物料的性质和土壤机械组成对球囊霉素含量的影响，以期为退化土壤修复提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试土壤均采自北京市昌平区南郝庄村（东经116°21′8″、北纬40°21′7″）的撂荒土地，取土深度为10～20 cm，土壤类型为潮土。土壤机械组成采用激光粒度分析仪（Mastersizer 2000）测定，土壤有机质和全氮含量分别采用重铬酸钾容量法和凯氏定氮法测定。其中，黏质土壤的理化性质为：黏粒含量34.2%，粉粒含量28.4%，砂粒含量37.4%，pH值7.4，有机碳含量7.37 g/kg，全氮含量1.09 g/kg，称为高黏粒土壤；黏壤质土壤的理化性质为：黏粒含量17.2%，粉粒含量43.3%，砂粒含量39.7%，pH值7.6，有机碳含量8.47 g/kg，全氮含量1.15 g/kg，称为中黏粒土壤；砂质土壤的理化性质为：黏粒含量6.2%，粉粒含量8.4%，砂粒含量854%，pH 值8.1，有机碳含量6.22 g/kg，全氮含量0.92 g/kg，称为低黏粒土壤。将采集的土壤样品风干，过2 mm筛，备用。

收集当地的猪粪有机肥、玉米秸秆和油菜秸秆3 种不同类型的有机物料。猪粪有机肥经过风干，玉米秸秆和油菜秸秆杀青后烘干，上述干燥后的有机物料粉碎分别过2、0.147 mm 筛，备用。

1.2 试验设计

因为上述供试土壤间的微生物活性和群落结构并不一致，可能会对研究土壤质地影响有机物料腐解过程产生干扰，所以，将上述供试土壤先通过高压灭菌后（121 ℃，209 kPa，30 min），称取上述灭菌后的土壤200 g，接种相同的土壤菌剂，土壤含水量调节至田间持水量的60%，培养7 d 后（25 ℃），使上述供试土壤在培养试验开始前有较为一致的微生物活性和群落结构。然后，向高黏粒、中黏粒和低黏粒土壤中分别加入10 g 上述猪粪有机肥、玉米秸秆和油菜秸秆3 种有机物料，不加有机物料的土壤为空白对照，共计12 个处理，每个处理设置5 个重复。将有机物料和土壤充分混匀后，采用封口膜密封培养瓶口，25 ℃下避光培养120 d，期间通过称重法补充水分[9]。

土壤菌剂的提取：按照水土比15∶1 的比例，将去离子水与鲜土（0～20 cm）混合，并加入数粒玻璃珠，振荡（200 r/min）2 h 后，离心（1 000 g）10 min，收集沉淀后的土壤颗粒，继续加入相同的去离子水，振荡并离心，上清液即为土壤菌剂[9]。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 供试土壤和有机物料基本理化性质测定 选用过0.147 mm 筛的有机物料，用碳氮分析仪（Vario MAX CN）分别测定其碳氮含量；利用固体核磁（Bruker AV 300 MHz）测其有机碳的化学组成，测试条件为：魔角自旋频率为10.0 kHz，共振频率为100.6 MHz，脉冲延迟时间0.5 s，接触时间为2 ms，采集时间10 ms。将核磁测试图谱分为5 个化学位移区域，每一个区域代表一种特定的有机基团，0～45 mg/kg 为烷基碳（Alkyl-C）、45～60 mg/kg为含氮烷基碳（N-alkyl C）、60～90 mg/kg 为单烷氧基碳（O-alkyl C）、90～110 mg/kg 为双氧烷基碳（di-O-alkyl C）、110～160 mg/kg 为 芳 香 族 碳（Aromatic C）、160～190 mg/kg 为 羰 基 碳（Carboxyl C）。采用MestReNova-9.0.1 软件对上述不同的位移区域进行积分、定量分析。

1.3.2 土壤微生物量碳和氮含量的测定[10]称取培养后的新鲜土壤样品12.5 g 于100 mL 离心管中，放入抽气皿内，在抽气皿底部放入盛有无醇氯仿的小烧杯，抽真空使氯仿沸腾5 min，密封后避光培养24 h（25 ℃），同时，另称取一批同等质量的土壤于100 mL 离心管中，不做熏蒸处理，在相同的条件下培养24 h。培养结束后，在通风橱内使氯仿散尽，加入50 mL 0.5 mol/L 的K2SO4溶液，振荡30 min，离心过滤，收集滤液，采用碳氮分析仪（MULTI N/C2100）测定滤液中的有机碳含量。

1.3.3 土壤球囊霉素含量的测定[11]称取2.00 g过2 mm 筛培养后的风干土壤样品于50 mL 的离心管中，并加入16 mL 的柠檬酸钠溶液（浓度为20 mmol/L，pH=7），放入高压灭菌锅中（121 ℃，103 kPa）工作30 min，离心（8 000 r/min）并收集上清液，即为易提取态球囊霉素待测液。同样，称取1.00 g 过2 mm 筛培养后的风干土壤样品到50 mL的离心管中，加入16 mL 的柠檬酸钠溶液（浓度为50 mmol/L，pH=8.0），在121 ℃、103 kPa 条件下工作60 min，重复提取5 次，离心收集所有上清液，即为总球囊霉素待测液。采用考马斯亮蓝染色法测定上述待测液中球囊霉素的含量，吸取上述球囊霉素提取液0.5 mL 于10 mL 的离心管中，并加入5 mL 的考马斯亮蓝染色剂（G-250），完全显色后（10 min）在595 nm 波长下比色（UV-2700，岛津），测其吸光度，根据牛血清蛋白标准曲线，计算球囊霉素的含量。

1.3.4 土壤磷脂脂肪酸（PLFA）的测定[12]每个处理选择3 个重复进行土壤磷脂脂肪酸含量的测定，称取冷冻干燥后的土壤样品5.0 g，加入25 mL 的提取剂（将甲醇、氯仿、柠檬酸溶液按照2∶1∶0.8 的比例混合），振荡（25 ℃）2 h 后离心，收集上清液，向离心后残留的土壤中继续加入7.6 mL 的提取剂，振荡离心，将上清液统一转移至玻璃试管中。然后继续向玻璃试管中加入6 mL 的氯仿和4.8 mL 的柠檬酸缓冲液，静置12 h，分层后将上层氯仿溶液转移至新的玻璃试管中，氮气吹干。采用氯仿清洗的SPE 柱（Supelco 公司）分离上述提取的磷脂脂肪酸，加入200 μL 9.918 7×10-2nmol/μL 的十九脂肪酸甲脂（C19∶0）作为内标，继续用氮气吹干。然后进行磷脂脂肪酸的甲酯化，向分离后的磷脂脂肪酸中加入1 mL 的甲醇溶液（0.2 mol/L）和1 mL 的甲醇甲苯（体积比1∶1）混合液，水浴加热（37 ℃、15 min）进行甲酯化，继续加入0.3 mL 的乙酸和2 mL 去离子水，再用正己烷（C6H14）萃取甲酯化的磷脂脂肪酸，氮气吹干。采用气相色谱（N6850，Agilent）对磷脂脂肪酸进行定量分析，选用MIDI Sherlock 微生物鉴定系统对其进行定性分析[13]，将i14∶0、i15∶0、i16∶0、i17∶0、a15∶0、a17∶0、cy17∶0、cy19∶0w8c、16∶1w5c、16∶1w7c、16∶1w9c、17∶1w8c、18∶1w5c、18∶1w7c 表征为细菌，18∶2w6 和8∶2w9c 表征为真菌，磷脂脂肪酸的含量单位为nmol/g。

1.4 数据处理

试验数据用Excel 2016 整理，运用Origin 18.0计算、绘图，运用SPSS 17.0 进行Pearson 相关性分析、双因素方差分析和差异显著性分析（Duncan，P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 有机物料理化性质的分析

3 种有机物料的碳、氮含量如表1 所示。

表1 3 种有机物料的碳、氮含量Tab.1 The organic carbon and nitrogen contents of the three organic amendments

3 种有机物的理化性质有较大差异（表1），其中猪粪有机肥的含氮量最高，为29.3 g/kg，有机碳含量和C/N 最低，分别为284.2 g/kg 和9.7。而玉米秸秆的含氮量最低，为5.1 g/kg，C/N 最高，为85.8。固体核磁结果表明（图1），猪粪有机肥富含烷基碳、含氮烷基碳，油菜秸秆富含芳香碳，玉米秸秆则含有更多的含氧烷基碳和木质素。

图1 3 种有机物的化学结构Fig.1 The chemical structures of three organic amendments

2.2 各处理间微生物量碳和氮含量分析

从图2 可以看出，与不添加有机物料的处理（CK）相比，猪粪、玉米秸秆和油菜秸秆可以显著提高土壤微生物量碳和氮含量（P<0.05）。在中黏粒和高黏粒的土壤中，猪粪处理的土壤微生物量碳含量要显著高于玉米秸秆处理（P<0.05）。但是，在低黏粒土壤中，3 种有机物料处理之间的微生物量碳和氮含量并没有显著性差异（P>0.05）。土壤质地同样可以显著影响土壤微生物量碳和氮含量（P<0.000 1）（表2），其中，高黏粒和中黏粒土壤处理中微生物量碳含量要显著高于低黏粒土壤处理（P<0.05），而中黏粒土壤处理中的微生物量氮含量最高，且显著高于高黏粒和低黏粒土壤处理（P<0.05）。

图2 各处理中土壤微生物量碳和氮含量Fig.2 The soil microbial biomass carbon and nitrogen contents in the different treatments

2.3 各处理间土壤球囊霉素含量分析

球囊霉素含量受土壤质地和有机物料类型的共同影响（P<0.01）（表2），与不添加有机物料的处理（CK）相比，猪粪、玉米秸秆和油菜秸秆可以显著提高土壤易提取和总球囊霉素的含量（P<0.05），且猪粪处理>油菜秸秆处理>玉米秸秆处理（图3）。在添加有机物料后，高黏粒和中黏粒的土壤易提取和总球囊霉素的含量均显著高于低黏粒土壤（P<0.05）。

表2 双因素方差分析土壤质地和有机物类型对球囊霉素和微生物量碳、氮含量的影响Tab.2 The influence of the soil texture and organic amendments types on glomalin and microbial biomass carbon and nitrogen analyzed by the two-way ANOVA

图3 各处理中易提取球囊霉素和总球囊霉素的含量Fig.3 The easily extractable glomalin and total glomalin contents in the different treatments

2.4 土壤质地和有机物料的性质对微生物群落的影响

土壤质地和有机物料的性质均对微生物含量和群落结构有较大影响（表3、图4），各处理的细菌、真菌以及总磷脂脂肪酸含量均为猪粪有机肥处理>油菜秸秆处理>玉米秸秆处理>CK（P<0.05）。细菌磷脂脂肪酸的含量随着土壤黏粒含量的增加呈逐渐升高的趋势（P<0.05），但是真菌磷脂脂肪酸的含量则呈中黏粒土壤>高黏粒土壤>低黏粒土壤（P<0.05），导致高黏粒土壤中有较高的细菌/真菌（P<0.05）。并且，高黏粒和中黏粒土壤中的总磷脂脂肪酸含量显著高于低黏粒土壤（P<0.05）。

图4 各处理中细菌、真菌和总磷脂脂肪酸的含量Fig.4 The bacteria，fungi and total PLFA contents in the different treatments

表3 双因素方差分析土壤质地和有机物类型对细菌、真菌和总磷脂脂肪酸含量的影响Tab.3 The influence of the soil texture and organic amendments types on the bacteria，fungi and total PLFA contents analyzed by the two-way ANOVA

2.5 土壤质地和有机物料的性质对球囊霉素和微生物量碳、氮含量的影响

通过Pearson 相关性分析土壤质地和有机物料性质与球囊霉素和微生物量碳、氮含量间的关系（表4），微生物量碳含量与土壤黏粒呈显著正相关（P<0.05），但是与土壤砂粒呈显著负相关（P<0.05）。对于易提取和总球囊霉素含量，虽然其与土壤的黏粒和粉粒呈正相关，与土壤的砂粒呈负相关，但相关性并不显著（P>0.05）。有机物料的性质对微生物量碳、易提取和总球囊霉素含量的影响极显著（P<0.01），其中有机物料的含氮量和C/N分别与微生物量碳、易提取和总球囊霉素含量呈极显著的正相关和负相关（P<0.01）。

表4 土壤质地和有机物性质与球囊霉素和微生物量碳和氮含量间的Pearson 相关性分析Tab.4 The Pearson correlation analysis between glomalin content，microbial biomass carbon and nitrogen and soil texture and organic amendments properties

3 讨论

3.1 有机物料性质对土壤球囊霉素含量的影响

添加有机物料可以显著提高土壤微生物量碳和氮以及球囊霉素的含量，但是，与玉米秸秆处理相比，猪粪有机肥和油菜秸秆处理的提升幅度更大。这主要是因为猪粪有机肥和油菜秸秆的含氮量较高、C/N 更低，且含有更多烷基碳、含氮烷基碳和羰基碳，是多糖、蛋白类物质的主要有机基团[14]，在土壤中容易腐解，活性有机物质能够迅速被微生物所同化，促进微生物的生长繁殖，并有利于微生物分泌更多的多糖类物质以及真菌菌丝的生长[15]，最终导致球囊霉素在土壤中大量累积。ZHANG等[16]研究发现，与秸秆类有机物料相比，腐熟的猪粪有机肥在土壤中可以快速释放大量的富含羰基碳、含氮烷基碳的可溶性有机碳，这些活性有机碳极易被微生物分解、利用，进而显著提高微生物的活性。

对于玉米秸秆处理，其C/N 较高，且富含木质素，化学结构相对稳定，在土壤中分解速率较为缓慢[17]，微生物在分解这类有机物时较为困难，缺少足够的碳源和养分刺激微生物的活性和数量，所以，玉米秸秆处理的细菌、真菌含量较低，最终导致微生物量碳和氮以及球囊霉素含量显著低于其他有机物处理。但是，相关研究认为，富含芳香碳和木质素的低质量类有机物对土壤微生物的刺激以及土壤有机质的提升效果虽然在腐解过程的初期较弱，但是效果较为持久[17-18]，即腐解较长时间后这类有机物在土壤中的残留率以及对微生物活性的影响要显著高于富含活性有机基团的高质量有机物料。而本研究的试验时间较短，不能观察到玉米秸秆腐解后期球囊霉素含量的变化，因此，需要在后续试验中加长试验时间，动态监测有机物料腐解过程中球囊霉素的变化规律。

3.2 土壤质地对球囊霉素含量的影响

本研究表明，土壤质地对球囊霉素的影响显著，并且黏粒含量较高的土壤处理中球囊霉素含量要显著高于黏粒含量较低的土壤处理。这主要是因为黏粒含量较高的土壤可以形成结构性较为良好的团粒结构[19]，为微生物生长繁殖提供较为稳定的环境。有研究发现，土壤黏粒含量与细菌群落的多样性呈正相关[20]。本研究同样发现，黏粒含量较高的土壤含有更高含量的微生物量碳和氮以及细菌磷脂脂肪酸含量，并且微生物量碳含量与土壤黏粒含量呈显著正相关。这是由于土壤黏粒拥有较大的比表面积，其表面较多的活性位点更有利于微生物的定殖[8]。但是，本研究中球囊霉素含量与土壤黏粒含量并没有呈现显著的正相关关系，主要是因为高黏粒土壤处理的黏粒含量太高，土壤孔隙较少，透气性较差，影响了真菌类微生物的生长繁殖[21]。本研究同样发现，高黏粒土壤中的真菌含量显著低于中黏粒土壤处理。PREUSSER 等[22]研究发现，真菌更易在孔隙度较大的土壤中生长，真菌菌丝更容易延伸，较大的孔隙为真菌的繁殖提供充足的氧气。大量研究表明，在质地较粗的土壤中真菌的多样性更为丰富[23]。在大田中，影响微生物的活性以及球囊霉素累积的因素比较复杂（例如，环境温度、降水量、施肥制度等），其中，土壤养分和水分含量、温度、通气性等因素最为直接。但是，土壤水分的保持和温度的调节能力很大程度上与土壤孔隙性质密切相关，而土壤的机械组成直接决定土壤孔隙性质。因此，优良的土壤质地是微生物生长繁殖以及球囊霉素累积的基础，更有利于土壤肥力的快速提升。

4 结论

本研究结果表明，C/N 较低、富含烷基碳和含氮烷基碳的猪粪有机肥可快速促进微生物的生长繁殖，更有利于球囊霉素在土壤中的累积，并且受到土壤黏粒含量的影响。其中，黏粒含量较高的土壤更有利于微生物定殖，促进更多的球囊霉素在土壤中累积，但是，黏粒含量太高不利于真菌的生长。可见，有机肥对土壤的培肥效果与土壤黏粒含量密切相关。因此，在土壤培肥过程中要充分考虑有机肥的结构特点和土壤的质地类型。