hsa-miR-20a-3p靶基因预测及生物信息学分析

张 蕊

兰州大学公共卫生学院，甘肃省兰州市 730000

MicroRNA(miRNA)是由17～22个核苷酸组成且具有高度保守性的小单链RNA[1]。miRNAs不翻译成蛋白质，主要通过碱基互补配对的方式与靶基因结合来抑制其进一步的翻译表达，或通过RNA诱导直接降解靶标mRNA分子来调控靶基因mRNA的转录等方式起调控作用[2-3]。研究表明miRNAs在肿瘤、免疫性疾病、代谢性疾病、内分泌疾病等发病机制中起重要作用[4]。研究显示，hsa-miR-20a-3p在皮肤癌、胃癌等多种癌症的发生发展过程起重要作用[5-6]。目前对miR-20a-3p的致病分子机制仍有待研究，因此，本研究拟通过对hsa-miR-20a-3p进行生物信息学分析，为其靶点及相关疾病的致病机理的后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 hsa-miR-20a-3p保守性分析 在miRbase(http://www.mirbase.org)和UCSC(http://genome.ucsc.ed)等在线数据库查找miR-20a-3p的染色体定位信息及碱基序列，并采用MEGA 7.0软件对比分析各物种miR-20a-3p序列间的保守性。

1.2 hsa-miR-20a-3p靶基因预测 利用Targetscan(http://www.Targetscan.org)、TarBase(http://microrna.gr/tarbase)、miRDB(http://www.mirdb.org)、miRTarBase(http://www.mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)四大数据库预测hsa-miR-20a-3p的靶基因。用Venny图法先对miRDB、Targetscan和TarBase 3者预测的靶基因求交集，此外合并miRTarBase数据库中经实验证实的hsa-miR-20a-3p靶基因形成靶基因集合用于后续分析[7]。

1.3 hsa-miR-20a-3p靶基因的GO功能注释和KEGG信号通路分析 应用数据库DAVID 6.8(http://david.abcc.ncifcrf.gov)对hsa-miR-20a-3p的靶基因集合进行GO功能(Gene ontology)注释分析和KEGG信号通路富集分析。GO功能注释包括细胞组分、分子功能、生物功能3大应用部分[8]。用Fisher确切概率法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各物种成熟miR-20a-3p序列的保守性分析 结果显示hsa-miR-20a-3p基因序列号为MIMAT0004493，聚集于13q31.3染色体区域中的一个簇内，其基因位点在染色体的具体位置为chr13:91351108-91351129。利用数据库miRbase下载Homo sapiens(人)、Capra hircus(山羊)、pteropus alecto(狐蝠)、Cavia porcellus(豚鼠)等10个物种的miR-20a-3p的成熟序列。对比分析发现miR-20a-3p成熟碱基序列中“acugcauuaugagcacuuaaag”22个碱基在各物种间高度保守，结果见表1。

表1 不同物种miR-20a-3p成熟序列

2.2 hsa-miR-20a-3p的靶基因预测结果 利用Targetscan、miRDB和TarBase 3个在线数据库得到靶基因个数分别为4 387、716和699，通过取交集得到66个靶基因，结果见图1a。另外，在miRTarBase数据库中查找经实验证实的靶基因共92个，其中有ADSS和YWHAQ两个靶基因与上述交集重合，因此得到156个无重复的靶基因集合作为后续生物分析，结果见图1b。

图1 hsa-miR-20a-3p的预测靶基因个数

2.3 hsa-miR-20a-3p预测靶基因的GO功能注释描述 GO功能注释发现hsa-miR-20a-3p靶基因集合富集在核浆、细胞质、细胞核等9个细胞组分(P<0.05)；富集在蛋白质结合、染色质结合、DNA结合等11个分子功能(P<0.05)；富集在前脑形态发生、学习或记忆、器官诱导、基因表达调控等15个生物学过程(P<0.05)，结果分别见表2～4。

表2 hsa-miR-20a-3p预测靶基因的细胞组分

表3 hsa-miR-20a-3p预测靶基因分子功能

表4 hsa-miR-20a-3p预测靶基因生物学功能

2.4 hsa-miR-20-3p预测靶基因的KEGG信号通路富集分析 KEGG富集分析结果显示hsa-miR-20a-3p的靶基因显著富集在病毒致癌、乙型肝炎、HTLV-Ⅰ(人类T细胞白血病病毒)感染等信号通路中(P<0.05)，结果见表5。

表5 hsa-miR-20-3p靶基因KEGG信号通路富集分析

3 讨论

近年来，hsa-miR-20a-3p在癌症等多种疾病中的差异表达已得到广泛研究，miRNA已成为一种多效的致癌或抑癌调节因子，作用尚未完全被了解[5-6]。目前也缺乏其潜在靶点和相关功能通路的全面分析，生物信息学能快速预测miRNA靶基因集合和相关的生物功能，具有一定的可靠性。本研究通过生物信息学分析方法发现miR-20a-3p已知的成熟序列在人、猕猴、野猪、锦龟和豚鼠等多个物种间高度保守，表明其可能编码了与生命活动密切相关的蛋白质，且可利用在豚鼠等其物种间的保守性序列，将常见的模式生物作为研究miR-20a-3p生物学作用的实验支持工具；采用目前常用的miRNA靶基因预测方法为使用多种靶基因预测软件进行预测，为了提高预测结果的可靠性，利用数据库靶基因交并集来获取所需研究的靶基因集合，本研究所得无重复hsa-miR-20a-3p靶基因共156个，GO功能分析结果显示靶基因主要富集在核浆、细胞质和细胞核等9个细胞组分，富集在蛋白质结合、染色质结合、转录调控区DNA结合和损伤DNA结合等11个分子功能，富集在前脑形态发生、学习或记忆、器官诱导、代谢过程调节和基因表达调控等15个生物学过程，KEGG分析结果显示hsa-miR-20a-3p的靶基因显著富集在病毒致癌信号通路、乙型肝炎信号通路和HTLV-Ⅰ感染信号通路中。

已有研究表明miR-20-3p与癌症具有密切关系，如miR-20-3p的过表达可调控靶基因CSNK2A1来促进结肠癌细胞增殖诱发结肠癌[9]，通过调控CADM1来抑制部分抑癌基因的正常表达来诱发肺腺癌[10]等来发挥致癌作用，已成为多种癌症早期筛查及预后的标志物，并成为癌症的治疗靶点。研究发现T2DM患者的促血管生成和抗血管生成hsa-miR-20a-3p丰度存在差异，这些患者血管生成受损导致血管并发症发生的潜在机制与其靶向调控血管生成和脉管系统发育有关，且与其他miRNA产生协同调节T2DM病患者中与血管生成有关的MTDH和PDCD10的两个基因，参与促血管生成和抗血管生成等不同的生理过程[11]。肝脏中miR-20a-3p表达显著下调，可能因为其与c-Myc基因的激活有关，使其参与了急性缺氧应激调节[12]。研究表明miR-20a-3p在胃癌患者机体通常下调，可与β-连环蛋白信号通路之间相互作用，Wnt/β-连环蛋白信号通路的异常激活在许多恶性肿瘤尤其是胃癌的发生和发展中起着重要作用[13]。miR-20a-3p、miR-21等在研究中被报道与健康长寿相关，细胞衰老是体内固有的肿瘤抑制机制，同时也是与年龄相关的组织退化和功能障碍的主要驱动力，相关的miRNA可能会成为衰老的标志物[14]。还有研究发现在结核分枝杆菌感染期间，miR-20a-3p呈剂量和时间依赖性增加，其上调促进了细菌的胞内生长，并抑制了结核分枝杆菌感染的RAW264.7和BMDM细胞中促炎细胞因子的释放，而miR-20a-3p的下调具有相反的效果。此外，miR-20a-3p通过直接靶向IKKβ抑制NF-κB通路的活性，从而抑制促炎细胞因子和减弱机体免疫反应，促进结核分枝杆菌的存活致病[15]。

综上所述，研究显示hsa-miR-20-3p所调控的部分靶基因在生命过程及疾病中的作用是值得进一步的研究和探索，本文预测与其他相关文献报道是基本相符的，尤其是病毒致癌过程是值得进一步研究的方向，对临床治疗的新靶点提供理论基础，靶基因预测结果有待后续实验验证。