基于UPLC-MS/MS的不同产地金观音红茶代谢组学分析

林洁鑫，颜廷宇，邵淑贤，王鹏杰，叶乃兴，金 珊，吴芹瑶，郑德勇，杨江帆

(1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建福州 350002；2.福建农林大学材料工程学院，福建福州 350002；3.福建商学院，福建福州 350002)

红茶是我国六大茶类之一，属于全发酵茶，由于其独特的滋味和香气成为世界上消费量最大的茶类。福建是红茶的发明地，其主产区分布在闽东和闽中一带，由于茶叶的品质与生长环境密切相关，使得不同产地的红茶具有特定的品质特征。随着人们生活水平提高，消费者对确认茶产品原产地的需求明显增加，目前常用的茶叶感官审评方法，不仅其结果易受多种因素影响，也很难以据此判别茶叶的产地。因此，从保护消费者利益与福建茶叶区域品牌建设的需要出发，探究一种客观、科学的茶叶产地与品质鉴别技术十分必要。

气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、近红外光谱(NRIS)、稳定性同位素(IRMS)、矿物质元素测定等检测技术在鉴定食品的产地与品质方面取得一定成功，国内外学者开始将此类技术手段引入到茶叶的产地判别与品质鉴别研究中，并取得了重要进展。代谢组学作为一门新兴综合性技术，通过高通量检测和多元数据处理方法将样品检测的全部信息系统性整合起来，具有耗时短、准确度高和广覆盖的特点，能够在定性定量检测样品中小分子代谢产物的基础上，提取出与样品的品质或(和)产地关联的关键信息，达到更全面、准确鉴别的目的。徐春晖等利用非靶向代谢组学分析方法结合多元统计分析对3种江西名茶品质构建预测模型，准确度可达100%，且3种茶叶的代谢物存在较大差异。郑起帆等采用核磁共振氢谱技术(H-NMR)结合判别分析能较准确地对不同茶山普洱生茶进行分类，发现缬氨酸、绿原酸、奎尼酸等代谢物对不同茶山分型贡献较大。王春波等利用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱技术和多元统计方法成功区分贵州3个不同产区都匀毛尖，并且筛选出6种差异显著的产地标志物。目前关于不同产地红茶的代谢组学研究仍较为欠缺。

笔者所在课题组曾利用代谢组学技术研究了福云6号制成的红茶，显著区分了红茶的产地，并发现氨基酸和黄酮类物质对产于福建省福安市和尤溪县的红茶滋味品质间的差异具有重要贡献。由于不同产地红茶的滋味品质是受各种因素综合影响的，为了更全面地比较分析2地红茶品质的差异，进一步以金观音单一品种制成的红茶为研究对象，采用广泛靶向代谢组学技术结合多元统计方法筛选差异代谢物进而区分不同产地的红茶，分析形成红茶滋味品质差异的可能原因，以期为福建红茶的品质评价、产地鉴别及溯源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料共23份，于2020年3月分别收集自福建省尤溪县的坂面镇、台溪乡，以及福安市的城阳镇、上白石镇、社口镇、松罗乡；其中产自尤溪县的红茶有13份，产自福安市的红茶有10份，全部茶样均是金观音单一品种制成的成品红茶，且等级相似。参照GB/T 23776—2018茶叶感官审评方法，由6名高级评茶员对23份茶样的滋味进行评价与评分，最后从2个产地各筛选出1份具有代表性的茶样进行后续的代谢组学分析，试验所用茶样具体信息见表1。

表1 红茶样品信息

1.2 样品制备方法

将样品放入5 mL离心管，置于冻干机中真空冷冻干燥，用30 Hz的研磨仪研磨约1.5 min，再称取100 mg样品粉末，用1.2 mL 70%的甲醇水溶液溶解，每30 min涡旋提取30 s、重复6次后置于4 ℃冰箱过夜；经12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，使用0.22 μm滤膜过滤并储存于进样瓶中，2个产地的红茶样品，分别重复取样3次、制备后进行UPLC-MS/MS分析。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相：A相为超纯水(含0.1%甲酸)，B相为乙腈(含0.1%甲酸)；洗脱梯度：B相比例为5%→95%，时间0.00～9.00 min；B相比例95%维持9～10 min；B相比例95%→5%，时间10.00～11.10 min；B相比例降为5%平衡至14 min；柱温 40 ℃；进样量4 μL；流速0.35 mL/min。

1.4 质谱条件

利用电喷雾离子源(ESI)进行海量数据采集，温度为550 ℃，离子喷雾电压(IS)5 500 V(正离子模式)/-4 500 V(负离子模式)。在三重四级杆(QQQ)中，每个离子对根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测。

1.5 数据处理

通过比较色谱保留时间、离子碎片值和相对丰度，并采用迈维(武汉)生物技术有限公司自建数据库和公共数据库对代谢物进行鉴定。利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)对代谢物进行定量，获得样品的代谢物质谱数据并对其进行峰面积积分以及校正。采用R软件(https：//www.r-project.org/)对鉴定的代谢产物进行PCA分析和OPLS-DA分析，利用OPLS-DA模型获得的VIP值评分，根据VIP≥1、fold change≥2或fold change≤0.5进行显著差异代谢物(SCMs)的筛选，同时通过代谢通路KEGG Pathways进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同产地红茶代谢组学分析与代谢物的多元统计

利用广泛靶向代谢组学技术，在尤溪红茶、福安红茶中共检测到936种代谢物，PCA分析和OPLS-DA分析显示，不同产地红茶的代谢物能够明显分离(图1-A、图1-B)。根据OPLS-DA分析得到的VIP值(VIP≥1)和FC值(fold change≥2或fold change≤0.5)筛选差异代谢物，共筛选出96种显著差异代谢物。火山图(图1-C)显示，上调的代谢物有50种，即尤溪红茶相对含量较高的差异代谢物有50种；下调的代谢物有46种，即福安红茶相对含量较高的差异代谢物有46种。这些差异代谢物大致可分为11类，包括氨基酸及其衍生物、酚酸类、核苷酸及其衍生物、黄酮类、生物碱、脂质和有机酸等(图1-D)，其中黄酮类、鞣质和脂质在尤溪红茶中的相对含量更高，氨基酸及其衍生物、生物碱和有机酸在福安红茶中的相对含量更高。

2.2 不同产地红茶差异性代谢产物

2.2.1 主要差异代谢物 将差异代谢物的FC值进行log处理，得到差异变化在前20的差异表达代谢物(图2)。与福安红茶相比，尤溪红茶有4种黄酮类[杨梅素-3--(6″-丙二酰)葡萄糖苷、7，4′-二--没食子酰基特利色黄烷、杨梅素、圣草酚]，2种有机酸(2-甲基戊二酸、己二酸)，1种核苷酸及其衍生物(2′-脱氧腺苷)，1种酚酸类(绿原酸)和1种香豆素(7-甲氧基-5-异戊烯基氧基香豆素)的相对含量显著高于福安红茶；3种酚酸类(二氢咖啡酸、1，3，5-苯三酚、甲基丁香酚)，2种氨基酸及其衍生物(-乙酰--苯丙氨酸、--乙酰基--鸟氨酸)，2种核苷酸及其衍生物(-墨喋呤、环二-3′，5′-腺嘌呤核苷酸)，1种有机酸(马来酸)和2种其他类(4-甲基-5-噻唑乙醇、香草醇苷)的相对含量明显低于福安红茶。结果表明，尤溪红茶中相对含量较高的主要差异代谢物是黄酮类代谢物，而福安红茶中的则是酚酸类代谢物。黄酮类和酚酸类均属于多酚类物质，而多酚类物质的积累有利于形成醇厚鲜爽的滋味口感，由此可以推测，黄酮类和酚酸类物质在2个产地红茶滋味风格的差异上有一定的贡献。

2.2.2 主要差异代谢物热图 为了更直观地观察尤溪红茶、福安红茶差异代谢物之间的变化，我们得到了96种差异代谢物的热图(图3)，其中有6种氨基酸及其衍生物、7种核苷酸及其衍生物、18种黄酮类、5种鞣质、24种酚酸类、11种生物碱、11种有机酸、4种木脂素和香豆素、1种萜类、5种脂质和4种其他类物质。

游离氨基酸是茶叶中具有生物活性和味觉活性的物质，可赋予茶汤复杂的口感，如鲜味、甜味和苦味等，是影响红茶风味的重要因素。根据VIP值和FC值结果，发现2个产地红茶差异代谢物中 5-氧化脯氨酸、-丙酰甘氨酸、-天冬酰胺、--乙酰基--鸟氨酸、-乙酰--苯丙氨酸和-单甲基--精氨酸等6种氨基酸及其衍生物存在显著差异，且福安红茶中的含量都明显高于尤溪红茶，其中呈鲜味的-天冬酰胺的含量是尤溪红茶的2.3倍，这可能是由于2个产地地理位置的差异造成太阳光照强度不同引起的，与Ji等的研究结果一致。有研究发现，嘌呤类的核苷酸会呈现鲜味，虽然这种呈味核苷酸自身的鲜味较弱，但对茶汤滋味中的甜味、鲜味以及醇厚感起到一定的增强效果。从图3可以看出，福安红茶中的呈味核苷酸环二-3′，5′-腺嘌呤核苷酸和烟酸腺嘌呤二核苷酸的含量分别上调7.8倍和下调50%，所以认为呈味核苷酸可能会促进红茶鲜味的呈现，这与2个产地红茶的感官审评结果相似。

多酚类物质包括黄烷醇类、酚酸类和黄酮醇类等，是红茶中苦涩味和收敛性的主要成分。由图3可知，与福安红茶相比，尤溪红茶中相对含量较高的黄酮类代谢物有18种，增幅由大至小依次为杨梅素-3--(6″-丙二酰)葡萄糖苷、7，4′-二--没食子酰基特利色黄烷、杨梅素、圣草酚、槲皮素-3--(6″-没食子酰)半乳糖苷、丁香亭、杨梅素-3--芸香糖苷、表儿茶素、杨梅素-3--半乳糖苷-3′--鼠李糖苷、3，3′，4′，5，5′，7-六羟基黄酮、二氢槲皮素、杨梅素-3--葡萄糖苷、槲皮素-3--(6″-乙酰)半乳糖苷、3，3′，4′，5，7-五羟基黄烷(4→8)-3，3′，4′，5，7-五羟基黄烷、没食子儿茶素、3，3′，4′，5，7-五羟基黄烷-(4→6)-3，3′，4′，5，7-五羟基黄烷、芹菜素-7--芸香糖苷和5，7，3′，4′，5’-五羟基黄烷，其中非酯型儿茶素没食子儿茶素和表儿茶素分别显著上调2.1倍和2.4倍，这可能是由于2个产地地理区域的差异形成的。尤溪红茶中有6种黄酮醇类含量明显高于福安红茶，其中杨梅素含量显著上调3.5倍，相关研究表明，高海拔低纬度的区域，有利于合成较多的黄酮类化合物，其中黄酮醇类物质与茶汤滋味的厚度和鲜味呈反比，这有助于说明尤溪红茶中黄酮醇类代谢物含量更高的原因。

生物碱的主要成分为咖啡碱、茶碱和可可碱等，与茶汤的典型苦味密切相关，容易与儿茶素形成氢键络合物，提高茶汤滋味的鲜爽度和醇度，而在尤溪红茶、福安红茶中鉴定到的11种生物碱中，有9种生物碱(2-苯乙胺、异喹啉、-乙酰腐胺、色胺、吲哚-3-乙酸、1-甲氧基吲哚-3-甲醛、茶碱、乙酰色胺和二氢咖啡酰腐胺等)的含量在福安红茶中更高，其中茶碱的含量是尤溪红茶的2.3倍，所以这些生物碱在一定程度上会影响福安红茶的滋味特征。从图3可以看出，在鉴定到的有机酸代谢物中，大部分在福安红茶中显著累积，马来酸累积最高，明显上调3.5倍。除此之外，福安红茶中的2种溶血磷脂酰乙醇胺和1种溶血磷脂酰胆碱含量明显高于尤溪红茶，Li等研究已证实，磷脂的显著降解与绿茶香气的形成有重要关系，因此这3种磷脂降解产物可能对红茶香气的形成有一定的影响。

2.3 不同产地红茶差异代谢物通路

通过KEGG通路分析，共鉴定出41条代谢通路，被KEGG注释到的具有明显差异的代谢物个数为40个，其中有15个差异代谢物在尤溪红茶中相对含量较高，25个差异代谢物在福安红茶中相对含量较高，主要分布在20条代谢通路中(图4)，其中显著富集(值<0.05)的通路为苯丙氨酸代谢通路(Phenylalanine metabolism)和黄酮类生物合成通路(Flavonoid biosynthesis)，从一定程度上可以认为，这2条代谢通路对于不同产地红茶的滋味品质具有重要意义，这与Wu等的研究结果相符，说明代谢通路中涉及到的差异代谢物可以作为区分2个产地红茶品质差异的重要依据。

研究结果表明，苯丙氨酸代谢通路富集了苯丙酮酸、2-羟基苯乙酸、2-苯乙胺、-乙酰--苯丙氨酸和2-苯乙醇等5种明显差异的代谢成分，黄酮类生物合成通路富集了圣草酚、表儿茶素、杨梅素、没食子儿茶素、二氢槲皮素和绿原酸等6种明显差异的代谢成分，从相对丰度(图5)可以看出，苯丙氨酸代谢通路中的5种差异代谢物在福安红茶中的相对含量更高，其中-乙酰--苯丙氨酸上调3.5倍、2-苯乙胺上调2.6倍，2-苯乙胺作为一种神经递质，可以提高细胞外液中多巴胺的水平，具有使人感到身心愉悦的效果；与此相反，黄酮类生物合成通路中的6种差异代谢物则在尤溪红茶的相对含量更高，其中圣草酚、绿原酸含量较高，分别上调了3.3、3.0倍，绿原酸在茶汤中呈苦涩味，会随着浓度的增加而增强。由此可见，苯丙氨酸代谢通路和黄酮类生物合成通路作为关键通路，在不同产地红茶的品质差异中起主要作用。

3 讨论与结论

红茶独特的滋味和香气是由多种呈味成分协同作用的结果，而差异代谢物赋予了不同产地红茶的品质特征。相关研究认为，氨基酸和黄酮类差异代谢物可能是形成由福云6号品种制成的不同产地红茶滋味品质差异的原因，其中紫云英苷、表儿茶素、-谷氨酰胺、-天冬氨酸、-赖氨酸、-色氨酸、-谷氨酸、绿原酸、苯乙胺和牡荆素-2″--鼠李糖苷等差异代谢产物具有重要贡献。

在此基础上，本研究进一步探究不同产地金观音红茶代谢产物的差异，共筛选出96种明显差异代谢物，其中氨基酸及其衍生物(-天冬酰胺、-乙酰--苯丙氨酸等)、生物碱(茶碱、2-苯乙胺等)、酚酸类(二氢咖啡酸、甲基丁香酚等)等代谢物的相对含量在福安红茶中较高，黄酮类(杨梅素、圣草酚、丁香亭、表儿茶素等)代谢物的相对含量在尤溪红茶中较高，因此认为这些明显差异代谢物对不同产地红茶滋味品质差异的形成具有重要意义；苯丙氨酸代谢通路、黄酮类生物合成通路作为关键通路，在不同产地红茶的代谢差异中起重要作用，其中苯丙酮酸、2-羟基苯乙酸、2-苯乙胺、-乙酰--苯丙氨酸、2-苯乙醇、圣草酚、表儿茶素、杨梅素、没食子儿茶素、二氢槲皮素和绿原酸等可以作为区分不同产地红茶的重要依据。运用本研究结果，进一步探明了福安红茶、尤溪红茶品质特征差异的代谢物基础，可为福建省福安市、尤溪县今后红茶产品开发和生产提供参考依据。