苏姜猪SIRT7基因组织表达定位分析

王利红，张 伟，2，陈圣源，朱 军

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300；2.江苏姜曲海种猪场,江苏泰州 225300)

Sirtuin是一类NAD依赖的去乙酰化酶，具有Mono-ADP-Ribosyl转移酶活性，广泛分布于原核生物和真核生物中。真核生物Sirtuin家族基因共有7个成员，为～，这些成员被划分为4种类型，其中，、和为Ⅰ型，为Ⅱ型，为Ⅲ型，和为Ⅳ型。具有RNA聚合酶Ⅰ和包含组蛋白在内的多种rRNA活性紧密相关的生物学功能，如通过去乙酰化组蛋白底物和非组蛋白底物，参与细胞内的DNA损伤修复、抑制癌细胞增殖、诱导细胞衰老等过程。除NAD依赖的去乙酰化活性，还表现出其他的酶活性，如对H3K122去琥珀酰化、对H3K36/K37去丁酰化、对H4K91去戊二酰化、对SP7/Osterix去丙酰化及具有脱脂酰基转移酶活性等。Grob A等研究表明，在细胞的有丝分裂过程中，通过的C端区域被磷酸化，对rDNA的转录发挥调控作用；Vakhrusheva等研究证实，的表达水平与小鼠细胞系中肿瘤的发生紧密相关，在严重的应激情况下抑制细胞的生长，保证细胞能够尽量维持机体重要的新陈代谢通路。目前，有关猪基因表达研究较少，以苏姜猪为研究对象则鲜有报道。苏姜猪具有增质量快、瘦肉率高、繁殖性能强、肉质好等特点。本研究以成年苏姜猪为研究对象，检测分析()基因在多种脏器组织中的表达分布规律，研究结果可为丰富猪基因功能，深入开展该基因在苏姜猪脏器中的作用及对生长发育的影响研究提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设计

于2020年4月在江苏姜曲海种猪场随机选取同一日龄健康无病的育成苏姜猪(约90 kg)3头；屠宰采集心脏、肺、肾脏、肝脏、脾、胃、大肠、小肠、腹部脂肪、腿肌、背最长肌共11种组织样，每种组织样各采集3个重复，存于液氮中，用于组织中基因转录和翻译水平检测；同时，再采集各脏器组织样福尔马林溶液固定后用于组织中蛋白表达定位检测。

1.2 实时荧光定量(RT-PCR)检测

由表1可知，根据GenBank中猪基因序列(登录号：NM_001114272.1)和内参基因-(登录号：KU672525.1)，采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件设计RT-PCR引物；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 引物序列信息

使用TRIsol(Takara)提取所有组织样品中总RNA，并反转录成cDNA(按试剂盒说明操作)。

RT-PCR反应体系为20.0 μL，其组成由表2可见。反应条件为：95 ℃1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，40 个循环。

表2 RT-PCR反应体系组成

1.3 酶联免疫分析(ELISA)

取组织样约1.0 g匀浆后离心取上清液，按照SIRT7 ELISA检测试剂盒说明书进行操作，在 450 nm 波长下测量吸光度值(值)。

1.4 免疫组织化学染色分析

将石蜡组织样脱蜡、水化后，采用Tris-EDTA抗原修复，微波加热10 min，TBS洗涤，采用HO封闭过氧化物酶，Sirtuin 7抗体4 ℃孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗识别特异性一抗，DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水封片后镜检。

1.5 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 苏姜猪组织中SIRT7 mRNA相对表达量分析

采用实时荧光定量方法检测苏姜猪11个组织样中mRNA的表达量，采用2-ΔΔ法计算，以心脏中表达量定为1，并相对定量其他组织样中表达水平。

由图1可知，苏姜猪肠组织(大肠和小肠)中mRNA表达量显著高于其他组织中表达量(<0.05)；其次，在胃和肾脏组织中有较丰富的表达，显著高于其余组织中表达量(<0.05)；在肌肉组织(背最长肌和腿肌)中表达量相对最低。

2.2 苏姜猪组织中SIRT7蛋白表达量分析

通过酶联免疫吸附测定方法，对苏姜猪11个组织样中SIRT7蛋白表达水平进行检测，由图2可知，苏姜猪肠组织(大肠和小肠)中SIRT7蛋白表达量相对最高，显著高于除胃组织的其他组织样(<0.05)；其次是在肝脏、肺、脾、肾中有较丰富的表达；在心脏、腹脂和肌肉组织(背最长肌和腿肌)中SIRT7蛋白表达相对较少。

2.3 苏姜猪组织中SIRT7 mRNA和蛋白表达量间相关性分析

苏姜猪各组织中mRNA与蛋白表达量进行相关性分析，Pearson’s相关系数为0.810，=0.000，表明苏姜猪组织中mRNA和蛋白表达量间存在极显著相关(<0.01)。

2.4 苏姜猪组织中SIRT7蛋白的定位分布

采用免疫组织化学方法检测苏姜猪各脏器组织中SIRT7蛋白免疫阳性颗粒的表达定位分布，由图3可知，在苏姜猪各脏器组织中，SIRT7蛋白主要分布于肝、腹部脂肪、骨骼肌细胞的细胞质及脾脏的红髓区和红白髓区交界处细胞、肾脏组织近远曲小管细胞、肺支气管上皮细胞和肺泡细胞。在消化道系统的胃和肠组织的肌层细胞及黏膜层胃腺和肠腺细胞中分布有较多的SIRT7免疫阳性颗粒。

3 讨论与结论

SIRT7作为沉默蛋白Sirtuin家族成员，除去乙酰化酶活性外，还具有去琥珀酰化、去丁酰化、去豆蔻酰化等酶活性，在动物机体的生长发育和新陈代谢过程中具有重要的调节作用。Jin等在通城猪的脑、消化系统和脂肪等16种组织中检测到mRNA的广泛表达。本研究在苏姜猪的11个组织样中检测到基因在转录和翻译水平的表达，这与Jin等的研究结果相似，进一步证明该基因在猪脏器组织中的表达具有广泛性。对比苏姜猪组织中表达量，结果表明该基因在转录与翻译水平间存在极显著正相关性(<0.01)。

沉默蛋白Sirtuin家族的第7个成员(SIRT7)作为细胞内调控蛋白，其表达水平与细胞的代谢活动过程紧密相关，如在严重的应激情况下SIRT7可抑制细胞的生长。在细胞能量状态的调节过程中，SIRT7与RNA Pol I结合并通过NAD依赖的方式激活rDNA转录，过表达SIRT7促进RNA Pol I介导的基因转录，干扰SIRT7则起到抑制效果。Ford等研究发现，SIRT7主要在人体代谢活跃的组织，如肝、脾中有较高表达，在非增殖性组织，如肌肉、心脏和大脑中，SIRT7表达水平相对较低。本研究检测结果显示，苏姜猪消化系统如胃、大肠、小肠中有较高的SIRT7表达量，显著高于其他组织中表达量(<0.05)，其次是肾脏、肝脏、脾脏和肺组织，在非增殖性组织如肌肉和心脏组织中表达量相对最低。Jin等在通城猪的消化系统中也检测到较丰富的mRNA相对表达量。SIRT7蛋白主要分布于胃、大肠和小肠组织的消化腺细胞中，这表明消化腺细胞在利用其从周围血液中吸收的原料合成消化液，并分泌及贮存的主动活动过程中，基因具有重要的调控作用，其具体机制有待后续深入研究。

肾脏组织中沉默蛋白Sirtuin家族的第7个成员(SIRT7)可以去乙酰化KCC4，以维持肾脏集合管室中酸碱平衡。在苏姜猪的肾脏组织中，检测到仅次于消化系统的相对较高的SIRT7表达量，然而，Jin等在通城猪的肾脏组织检测相对较低的SIRT7 mRNA表达量，这种表达差异可能与不同品种猪的生理特征差异有关。经免疫组化检测，SIRT7蛋白主要表达分布于苏姜猪除肾小球外的近远曲小管细胞中，表明该基因的功能主要与肾脏近远曲小管的吸收与分泌功能有关。SIRT7是葡萄糖代谢的主要传感器，Sun等发现，葡萄糖饥饿会激活AMPK，使SIRT7 T153发生磷酸化，继而通过REG-蛋白酶途径降解，从而减少rDNA转录及蛋白质合成以避免细胞死亡。SIRT7缺失增加肝细胞内质网应激，导致肝脂肪变性，进而导致血脂异常。Jin等在通城猪的肝脏和3种不同部位的脂肪(腹脂、内脏脂肪、皮下脂肪)组织中均检测到SIRT7表达，本研究在苏姜猪肝脏和腹部脂肪细胞中也检测到SIRT7的表达，但其表达量相对较少。在苏姜猪肺组织中SIRT7蛋白主要分布于支气管黏膜层和肺泡细胞，其表达量相对较少，这与通城猪肺组织中相对较少的Sirtuin 7表达量结果相似；在脾脏组织中，SIRT7主要分布于脾红髓区和脾红白髓区交界处细胞，表明其主要参与脾脏组织免疫细胞的吞噬过程。

总之，SIRT7在苏姜猪组织中的表达具有广泛性，在消化系统中的表达量相对最高，显著高于其他组织中表达量(<0.05)；苏姜猪组织中SIRT7转录水平与翻译水平间存在极显著正相关(<0.01)；SIRT7蛋白主要分布于肌细胞、胃腺和肠腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、脾脏红髓区细胞、肾脏近远曲小管细胞、肺支气管上皮细胞和肺泡细胞中，表明基因主要与各脏器组织细胞的物质能量代谢和消化液分泌功能有关。