塔里木盆地于奇低幅度构造油气区土壤微生物特征

李 武，王国建，闫 欢，贾宝迁

1.中国石化 石油勘探开发研究院 无锡石油地质研究所，江苏 无锡 214126；2.中国石化 西北油田分公司 勘探开发研究院，乌鲁木齐 830011；3.中国科学院 微生物研究所，北京 100101

油气微生物勘探技术以烃类向地表垂直运移为理论基础，通过研究近地表土壤层中微生物数量及多样性特征，从而反映地下深部油气藏的分布，该技术可作为油气勘探的重要辅助手段[1-11]。检测地表油气微生物数量和群落结构异常的方法，主要包括传统平板培养法、分子生物学技术以及高通量测序技术，近年来相关技术已在准噶尔盆地、塔里木盆地、四川盆地、柴达木盆地和松辽盆地等多个勘探区进行了生产应用，取得了很好的成效[12-17]。

于奇地区是塔里木盆地塔河油区外围重要的油气勘探地区[18]。油气源对比结果表明，该区油气来源与塔河主体区一致，主要来源于海相烃源岩。根据该区具体的油气地质条件和邻区勘探情况综合分析，于奇地区具备形成油气藏的地质条件，具有较大的勘探潜力。其中于奇西部地区钻探的YQ3，YQ4，YQ5等井相继在三叠—白垩系3个油组中获得油气发现，更说明于奇地区油气成藏条件优越，具有良好的油气勘探潜力[18-20]。在于奇东部地区，YQ8井区奥陶系油气藏是以岩溶缝洞型储集体控制的弹性+水驱动的凝析气藏。YQD1井区与YQ8井区相邻，具有相似的构造背景和油气成藏地质条件，处于油气运移聚集的有利地区，而YQD1井至YQ8井目标区的油气勘探开发程度相对较低[18-20]。因此，本文采用16S rRNA高通量测序技术，研究于奇地区微生物物种丰度、多样性、群落结构等特征，并探索于奇地区潜在的油气指示菌，同时也初步分析了YQD1井至YQ8井勘探目标的油气富集点，为于奇东部地区油气勘探提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品采集

于奇地区位于塔里木盆地塔克拉玛干沙漠北缘，土壤多数为风沙土，十分干燥，地表植被稀疏，生物作用微弱，有机物质累积较少，而且人为活动不多，因此，人类活动和环境对土壤微生物的影响较小，适于开展油气微生物的研究工作。研究区土壤样品采集部署如图1所示。YQ5井东部为已知区(红色框)，部署采样点9个(YQC1，2，3，6，8，9，11，14，16)，命名为YQ-y；YQ12井西部为目标区(蓝色框)，部署采样点11个(YQC24—34)，命名为YQ-wz，两组样品共20个。采样点间距为500 m，每个采样点用取土钻钻取地表90 cm深度的土壤200 g，采样完成后用无菌袋密封，放入低温储藏箱保存，运至实验室进行土壤微生物种群结构多样性分析[21-22]。

图1 塔里木盆地于奇地区样品采样分布

1.2 土壤微生物总DNA提取及高通量测序

称取0.5 g土壤样品，按照FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)操作手册提取土壤中微生物总DNA，并测定浓度和质量检测。DNA样品委托上海美吉生物医药科技有限公司Illumina Hiseq 2500高通量测序平台进行16S rRNA V4区测序，扩增引物使用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)与806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[21-22]。扩增条件为：95 ℃，3 min，(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s)30个循环，72 ℃ 10 min。扩增产物进行胶回收和定量后进行高通量测序。获得的测序数据进行质控、过滤、拼接、参考序列比对，最终获得优化序列。基于优化序列进行可操作分类单元(OTU)聚类分析和物种分类学注释，统计每个样品注释到各分类水平上的序列数目，明确各分类水平的整体注释情况。基于OTU聚类结果进行多样性分析、物种群落结构分析和物种差异分析[23-28]。

2 实验结果

2.1 土壤中微生物OTU差异性比较

近地表土壤层中微生物组成可预测下伏油气藏的存在。为研究于奇地区土壤样品的微生物物种多样性等特征，以及YQ-y和YQ-wz两组的微生物有无差别，将于奇地区20个土壤样品进行高通量测序，基于97%的序列相似性将序列聚类成为可操作分类单元，最终获得了1 691种可分类的操作单元(OTU)。结果显示，两组土壤中所含微生物类群都很丰富，其中YQ-y和YQ-wz两组中共有的OTU种类1 426种，YQ-y中特有的OTU种类112种，YQ-wz中特有的OTU种类153种，两组土壤样品在整体水平上差异不明显，微生物类群具有相似性(图2)。

图2 塔里木盆地于奇地区土壤样品中微生物OTU韦恩图

2.2 土壤中微生物群落α多样性分析

在发现YQ-wz和YQ-y两组的物种组成具有一定的相似性、差异很小之后，进一步从整体群落角度全面研究和比较YQ-y和YQ-wz两组样品的α多样性特征，其中包括反映样本测序深度的实际OTU数(数值越高，表明样品物种丰富度越高)、物种丰富度指数Chao1(数值越大，代表样本中所含物种越多)、综合体现物种丰度和均匀度的多样性指数(香农指数、辛普森指数)等(图3)。从实际OTU数和Chao1指数结果判断，YQ-wz组样品中细菌数量、物种数均高于YQ-y组样品，香农指数说明YQ-wz组样品群落多样性高于YQ-y组样品，而辛普森指数在两组中差异不明显。

图3 塔里木盆地于奇地区土壤样品YQ-y和YQ-wz两组样品α多样性指数

2.3 土壤微生物群落的β多样性分析

生态系统中菌群各成员发挥功能受到各自临近的菌种以及环境因素影响。为了进一步研究YQ-y和YQ-wz两组样品的群落结构特点，利用物种群落间的距离来评估样本间物种群落的差异程度，即β多样性分析。本文以主成分分析和非度量多维尺度分析结果进行展示。

主成分分析是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法[29]，YQ-y和YQ-wz两组的主成分分析结果见图4。YQ-y和YQ-wz两组样品，组内和组间样品的距离都很接近，除了YQC27和YQC30样品点，其他各组样品点都能聚集，说明整体上两组的群落组成具有相似性，个别样品点特殊。

图4 塔里木盆地于奇地区土壤样品中细菌群落主成分分析

为了更进一步反映YQ-y和YQ-wz两组样品组间的细菌群落构成情况，采用非度量多维尺度分析，该分析是一种简化的以低维空间反映多维空间样本之间关系的数据分析方法，并用点的形式展示在二维平面图中，点与点的距离代表样品之间的差异程度(图5)。结果显示，除YQ-y三个样品点，其他样品点的差异程度较小，也说明整体上两组的群落组成是相似的。

图5 塔里木盆地于奇地区样品微生物群落组成非度量多维尺度分析

2.4 不同分类水平下土壤微生物的差异

上述结果表明两组样品整体微生物类群差异不大，但各样本在某一分类学水平上含有的微生物种类及其相对丰度(所占比重)可能存在差异，而不同物种的丰度也是反映含油气性以及油气指示菌的重要方式。为了研究于奇地区两组样本的物种分布以及物种丰度信息，综合统计了各样品的OTU聚类和注释结果，汇总每个样品注释到门和属分类水平上的序列数目，由此了解两组样品在门和属分类水平的整体注释情况。

根据物种注释结果，首先选取于奇地区两组样品在门水平丰度排名前10的物种，以叠加柱形图直观展示各物种在门水平所占比例(图6)。结果显示，于奇两组土壤样品中相对丰度排名前10的优势细菌分别为放线菌门(Actinobacteria)，变形菌门(Proteobacteria)，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，绿弯菌门(Chloroflexi)，厚壁菌门(Firmicutes)，广古菌门(Euryarchaeota)，浮霉菌门(Planctomycetes)，酸杆菌门(Acidobacteria)，疣微菌门(Verrucomicrobia)。其中，YQ-y组的芽单胞菌门(灰色)和拟杆菌门(黄色)比例较高，YQ-wz组的变形菌门(橘色)和绿弯菌门(浅蓝)比例较高，而且两组中均有大量的未知菌门，说明两组样品的微生物资源非常丰富；而且许多已知的油气指示菌属于芽单胞菌门和变形菌门，提示YQ-wz组样品含有油气的可能性很大。特别是YQC-30样品点，虽然在主成分分析(PCA分析)中差异较大，但其含有非常高丰度的变形菌门，可能存在油气指示菌，需要进一步分析其含油气性。

图6 塔里木盆地于奇地区土壤样本中门水平物种相对丰度

为深入研究于奇地区土壤样品中微生物相对丰度，明确是否存在油气指示菌，又进一步比较了两组样品中微生物在属水平相对丰度(图7)，发现于奇地区有大量的未知细菌，占土壤细菌总数的80%以上，说明于奇地区微生物资源丰富。于奇土壤样品中在属水平比例较高的菌主要是噬甲基菌属(Methylophaga)，拟杆菌属(Bacteroides)，类诺卡氏菌属 (Nocardioides)，粪杆菌属(Faecalibacterium)，普雷沃氏菌属9(Prevotella9)，芽孢杆菌属(Bacillus)，糖多孢菌属(Saccharopolyspora)，盐单胞菌属(Halomonas)，嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)，海杆菌属(Marinobacter)等，其中噬甲基菌属、拟杆菌属、类诺卡氏菌属和芽孢杆菌属都是能够利用轻烃为碳源的油气指示菌[24]。而且类诺卡氏菌属在顺北和新和已知油气地区也检测到并作为油气指示菌[16-17]。在这两组中，YQ-y组比例最高的菌属是拟杆菌属和类诺卡氏菌属，分别为2.978%和2.767%；YQ-wz组比例最高的菌属为噬甲基菌属和拟杆菌属，比例为2.191%和1.727%。两组中既有相同优势的油气微生物拟杆菌属，又有各自单独优势的油气微生物噬甲基菌属和类诺卡氏菌属。具体到不同样品，YQ-wz组YQC26和YQC29两个样品含有的已知油气指示菌较少，含油气的可能性较小。YQC28和YQC30两个样品含有的拟杆菌属和噬甲基菌属的比例最高，含油气的可能性很大。

图7 塔里木盆地于奇地区YQ-y和YQ-wz两组土壤样品中属水平物种相对丰度

基于以上结果分析，两组样品在门和属水平的微生物物种丰度差异不大。为了进一步说明样品间相似性，在属水平选取微生物丰度前50，进行聚类热图分析(图8)，以颜色变化与相似程度来反映于奇油气区与未知区在属水平上群落组成的相似性和差异性。通过聚类热图，发现两组样品聚类明显，特别是YQC25、YQC2和YQC9(YQX1井)，而且拟杆菌属这种油气指示菌的比例都较高。说明YQ-wz和YQ-y两组的物种丰度具有一定的相似性，YQ-wz中YQC25样品点含油气的可能性高。

图8 塔里木盆地于奇地区样品点物种属水平丰度聚类热图

整体而言，YQ-y和YQ-wz两组样品的微生物物种丰度、分布、群落结构等特征具有相似性，差异较小。采用不同的分析方法，有个别样品点的微生物特征存在差异，PCA分析发现YQC27和YQC30两个样品点不聚类，非度量多维尺度分析(NMDS)发现YQC27样品点群落组成差异较大。以YQ-y组样品为油气已知区综合分析YQ-wz组样品点，除YQC31和YQC34样品点与YQ-y组样品差异较大以外，其他样品点与YQ-y组样品种群结构相似，含油气的可能性都很高，需要结合地质资料和化探手段综合分析评估；YQC31和YQC34两个土壤样品含油气的可能性相对较小，这有待进一步深入分析和研究以确定其含油气性。

3 结论和讨论

(1)塔里木盆地于奇地区于奇西(YQ-y)和于奇东(YQ-wz)两组样品中所含微生物均很丰富，且共有OTU种类占绝对优势。YQ-wz组所包含的OUT种类、物种数和α多样性略高于YQ-y组。β多样性分析发现两组中多数样品点均能够聚类，仅个别样品点差异较大。

(2)于奇两组样品中微生物群落结构具有相似性，在门水平丰度由高到低依次为：放线菌门、变形菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门。在属水平丰度由高到低依次为：噬甲基菌属、拟杆菌属、类诺卡氏菌属、芽孢杆菌属、糖多孢菌属、盐单胞菌属、嗜盐芽孢杆菌和海杆菌属，其中噬甲基菌属、类诺卡氏菌属和芽孢杆菌属是可利用烷烃兼性生长的常见微生物。此外，于奇两组样品蕴含大量的未知微生物资源，未知微生物相对丰度占比80%以上。

(3)将细菌16S rRNA高通量测序技术应用于塔里木盆地于奇勘探区，初步掌握了该地区土壤微生物物种多样性和群落结构等特征。在今后研究中需进一步结合地质资料，考虑地表环境差异因素，增加油气井上方微生物分析数据，建立规范化和标准化的油气微生物数据库，促进微生物勘探技术的发展应用。