脓毒症患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平变化及其临床价值*

廖文超，钱 骏，王朋飞，方克宝

江油市人民医院重症医学科，四川绵阳 621700

因感染引发抗炎、促炎反应调节失常的全身炎症反应综合征称为脓毒症，随着病情发展，可出现脓毒性休克、多器官功能衰竭，进而危及脓毒症患者生命健康[1]。有研究表明，全球每年脓毒症患者约有1 900万，且患病年龄段趋向于年轻化，增加了家庭和社会的经济负担[2-3]。临床对引起脓毒症的各种细胞因子的研究结果表明，脓毒症与多种细胞基质异常密切相关，微小RNA-23b(miR-23b)作为新发现的微小RNA(miRNA)，能调控各种信号通路，刺激炎症细胞分泌炎症因子，进而参与脓毒症的发生、进展[4-5]；微小RNA-146a(miR-146a)作为可影响机体免疫系统的miRNA，其主要调控内毒素耐受机制，当其分泌量增多时，可造成内毒素过度表达，进而加速脓毒症病情发展[6]。吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)作为一种色氨酸代谢限速酶，主要由脏器淋巴、胸腺髓质分泌，可使色氨酸水平下降，从而对T细胞增殖、凋亡造成影响[7-8]。国内外对miR-146a、miR-23b、IDO在脓毒症中表达的研究多为单一分析研究，联合检测这3项指标在脓毒症中的表达水平并分析其临床价值的研究少见。基于此，本文对这3项指标在脓毒症患者中的表达水平及临床价值进行研究，为脓毒症的诊断、治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年1月至2019年1月本院重症监护病房(ICU)收治的105例脓毒症患者作为脓毒症组，另选择本院同期103例体检健康者作为对照组。纳入标准：所有研究对象无其他免疫性疾病，无心脏疾病，具有生活自理能力；脓毒症组符合《脓毒症中西医结合诊治专家共识》[9]中的诊断准则，体温>38.3 ℃，心率90次/分，低血压情况严重，伴有低氧血症、急性少尿;对照组体检指标正常，无脓毒症症状。排除标准：处于濒死状态的患者；合并器官移植、恶性肿瘤的患者；具有酗酒、熬夜不良习惯的患者；近期使用激素治疗的患者。脓毒症组与对照组性别、年龄、体质量指数(BMI)、血液黏度比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。按病情严重程度从轻到重将脓毒症分为3种类型：脓毒症为仅有全身炎症反应综合征；严重脓毒症为脓毒症伴有其所致的器官功能障碍和(或)低血压；脓毒性休克为感染引起的严重低血压且补液效果差。脓毒症组中有脓毒症36例，严重脓毒症34例，脓毒性休克35例。本研究获本院医学伦理委员会审核批准，所有研究对象或其家属均知晓本研究并签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

1.2方法

1.2.1标本采集 采集对照组体检当天和脓毒症组入院次日空腹静脉血9 mL，以3 000 r/min离心12 min，收集血清，将血清置于5 ℃低温箱中保存、待检。

1.2.2miR-23b、miR-146a检测 采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测两组miR-23b、miR-146a水平，检测方法：(1)总RNA提取。将保存的血清标本使用Trizol试剂提取总RNA，并使用核酸蛋白检测仪进行浓度检测。(2)cDNA合成。采用全式金公司TransScript®Ⅱ Reverse Transcriptas试剂盒方法，建立反应体系，包括总RNA 5 μL、RT反应缓冲液(10×)为2 μL、高质量(HPLC级别)dNTPs 1 μL、MMLV 1 μL、随机引物1 μL、补充无核酸酶水至20 μL。反应条件为50 ℃，30 min。(3)qPCR。采用全式金公司TransStart®Green qPCR SuperMix试剂盒方法，建立反应体系，包括cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、SYBR Green qPCR mix 10 μL，补充无核酸酶水至20 μL。以U6为内参，U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-CGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23b上游引物为5′-GATGTGTATCCTCAGAGCTTTG-3′，下游引物为5′-CGATGACAGAGATATCCCAG-3′；miR-146a上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGG-3′，下游引物为5′-CTCAACTGGTGTGCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTA ATCC-3′。PCR反应条件为预变性94 ℃ 1 min，94 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45个循环，72 ℃终末延伸6 min。(4)建立熔解曲线。在94 ℃、反应时间为60 s，接着在55～96 ℃，进行熔解，缓慢提升温度，每个反应各温度滞留35 s，重复45次，待反应结束，用电脑绘制熔解曲线，采用2-ΔΔCt法计算miR-23b、miR-146a的相对表达量。PCR仪器采用Gentier 96E全自动医用PCR分析系统(西安天隆科技有限公司)。

1.2.3IDO检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IDO，检测方法：冰箱取出人IDO ELISA试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司)，置于室温下30 min；据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，每个标准品和血清标本都做复孔。按照试剂盒说明书要求的比例稀释标准品，加入稀释好的标准品50 μL于标准品反应孔中，血清标本和样品稀释液1∶1稀释后加50 μL于样品反应孔中，每个反应孔加入50 μL的生物素标记的抗体，盖上膜板，轻轻振荡混匀，37 ℃温育1 h。甩去孔内液体，洗涤缓冲液清洗酶标板孔3次。然后每孔加入50 μL的链霉亲和素-辣根过氧化物酶，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min。甩去孔内液体洗涤缓冲液清洗酶标板孔3次。每孔加入底物A、B各50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃温育10 min。避免光照。取出酶标板，每孔加入50 μL终止溶液，终止反应；通过酶标仪(Multiskan FC 酶标仪，赛默飞世尔科技公司)在450 nm波长测定各孔的吸光度值。

1.2.4指标观察 统计所有研究对象的miR-23b、miR-146a、IDO水平。随访28 d时脓毒症患者的预后情况，并根据预后情况将患者分为存活组和死亡组。比较脓毒症组与对照组、不同病情严重程度和不同预后脓毒症患者的miR-23b、miR-146a、IDO水平，分析miR-23b、miR-146a、IDO单独和联合检测诊断脓毒症的效能及这3项指标间的相关性。

2 结 果

2.1脓毒症组和对照组血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比较 与对照组比较，脓毒症组血清miR-146a、IDO水平升高，miR-23b水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 脓毒症组和对照组血清miR-23b、miR-146a、IDO指标比较

2.2不同病情严重程度脓毒症患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比较 不同病情严重程度脓毒症患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，而且随着脓毒症病情严重程度加重，miR-146a、IDO水平逐渐升高，miR-23b水平逐渐降低，见表3。

表3 不同病情严重程度脓毒症患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比较

2.3不同预后脓毒症患者miR-23b、miR-146a、IDO水平比较 经随访，28 d时脓毒症患者死亡14例，存活91例。脓毒症患者死亡组miR-146a、IDO水平高于存活组，miR-23b水平低于存活组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同预后脓毒症患者miR-23b、miR-146a、IDO水平比较

2.4血清miR-23b、miR-146a、IDO水平间的相关性 相关性分析结果显示，miR-23b水平与miR-146a、IDO均呈线性负相关(r=-0.618、-0.623，P<0.001)，miR-146a水平与IDO呈线性正相关(r=0.552，P<0.001)，见图1。

注：A为miR-23b水平与miR-146a间关系散点图；B为IDO水平与miR-23b间关系散点图；C为miR-146a水平与IDO间关系散点图。

2.5血清miR-23b、miR-146a、IDO单独和联合检测对脓毒症的诊断效能 ROC曲线分析显示，血清miR-23b、miR-146a、IDO联合检测诊断脓毒症的曲线下面积(AUC)为0.846，高于miR-23b、miR-146a、IDO单项检测诊断脓毒症的0.796、0.808、0.734，差异均有统计学意义(P<0.05)；当约登指数最大时，miR-23b、miR-146a、IDO对应的最佳临界值分别为1.68、2.98、17.35 ng/L。见表5。

表5 血清miR-23b、miR-146a、IDO单独和联合检测诊断脓毒症的效能

3 讨 论

脓毒症是因感染引起的全身炎症反应综合征，可造成急性多器官功能障碍或在脓毒症的基础上出现补液难以纠正的低血压等症状，其发生的主要原因是严重烧伤、创伤、外科大手术后感染、缺血再灌注损伤等[10]。miR-23b是具有调节作用的miRNA，其具有调控基因表达及健康稳态细胞促氧化、抗氧化的能力，其分泌量下降会增强炎症反应，促进细胞黏，造成患者病情进一步恶化[11]。miR-146a可刺激白细胞介素-1受体相关激酶、肿瘤坏死因子受体相关因子6表达水平上升，加剧炎症反应，影响患者病情恢复[12]。IDO使色氨酸水平下降，进而对T细胞的增殖、凋亡及活性造成损害，并影响脓毒症治疗结局[13]。本研究检测ICU脓毒症患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平，为脓毒症诊断、治疗提供参考依据。

miRNA作为内源性短链非编码RNA，可与特异性RNA靶向结合，发挥降解、抑制靶基因的转录及翻译功能的作用[14]。有研究表明，miR-23b通过激活TAB2蛋白活性，在自身免疫缺陷疾病中发挥抑制炎症反应作用，并可影响炎症细胞分泌炎症物质，最终对免疫性疾病、脓毒症达到治疗目的[15]。本研究表明，脓毒症组血清miR-23b水平低于对照组(P<0.05)，并随着脓毒症病情严重程度的加重而降低，且死亡组血清miR-23b水平低于存活组(P<0.05)。miR-23b具有减轻炎症反应的作用，其水平升高会抑制细胞应激，促进炎症细胞凋亡，并靶向调控转化生长因子-β活性激酶，阻断相关信号通路，从而降低脓毒症炎症因子水平，结果显示，miR-23b通过降低炎症细胞增殖、分化能力及增强炎症细胞凋亡能力，从而使患者症状减轻，其可作为脓毒症临床诊断及预后判断的指标[16-17]。

miR-146a通过与肿瘤坏死因子受体相关因子-6、白细胞介素-1受体相关激酶-1的作用，正性调节炎症反应的信号通路，从而增强炎症细胞迁移、侵袭能力，加快炎症因子的分泌[18-19]。本研究显示，脓毒症组血清miR-146a水平较对照组升高(P<0.05)，并随脓毒症病情严重程度的加重而升高，且死亡组miR-146a水平高于存活组(P<0.05)。miR-146a通过刺激多种信号通路靶点，如CC类趋化因子5、Fas相关死亡域蛋白、白细胞介素-8等，加速免疫细胞凋亡，抑制免疫细胞分化过程，负反馈调控免疫反应，控制内毒素分泌，加速脓毒症恶化，加重了机体的损害，结果显示，miR-146a通过增强脓毒症患者的炎症反应而对机体产生作用，其具有较高的灵敏度和特异度，可作为早期判断脓毒症患者预后的指标，并为临床治疗脓毒症提供指导[20-21]。

IDO是除肝脏外唯一存在的可催化L-色氨酸分子中吲哚环裂解并犬尿酸途径降解的限速酶[22]。有研究表明，IDO利用色氨酸使T细胞增殖停止，分化受阻，并对T细胞产生毒性作用，抑制T细胞的活化，诱导其凋亡，降低活化T细胞的免疫功能，从而参与脓毒症的病情发展[23]。本研究显示，脓毒症组IDO水平高于对照组(P<0.05)，并随着脓毒症病情严重程度的加重而升高，且死亡组IDO水平高于存活组(P<0.05)。由此可见，IDO通过影响脓毒症患者机体免疫系统，从而加剧炎症反应，其可作为脓毒症预后判断的相关因子，为脓毒症患者转归提供理论参考。

Pearson相关分析结果显示，miR-23b水平与miR-146a、IDO均呈线性负相关(r=-0.618、-0.623，P<0.001)，miR-146a水平与IDO呈线性正相关(r=0.552，P<0.001)；进一步采用ROC曲线分析结果显示，miR-23b、miR-146a、IDO单独检测对脓毒症的诊断均有一定的价值(AUC均大于0.700)，而且这3项指标联合检测诊断脓毒症的价值更高。本研究尚存在不足，如虽然揭示了miR-23b、miR-146a、IDO紧密联系，但未深入判断三者相互反应机制，需要扩大样本量，继续对这3项指标进行研究。

综上所述，脓毒症患者血清miR-146a、IDO水平升高，miR-23b水平降低，这3项指标密切相关，可为脓毒症的诊断、病情严重程度和预后判断提供新的参考依据。