多花水苋对苄嘧磺隆的抗性水平及靶标抗性机制

杨 倩, 卫 甜, 朱锦磊, 刘怀阿, 吕 敏

(江苏里下河地区农业科学研究所，江苏 扬州 225007)

多花水苋Ammannia multifloraRoxb. 是千屈菜科Lythraceae 水苋菜属AmmanniaLinn. 杂草，主要分布在我国南部各省份，常生于湿地或水田中[1]。近年来，多花水苋在我国江苏省和浙江省等地稻田发生严重，已成为区域性杂草，对水稻产量和品质构成了严重威胁[2-3]。苄嘧磺隆属于乙酰乳酸合成酶 (ALS) 抑制剂中的磺酰脲类除草剂，是我国稻田防除阔叶杂草和莎草的主要药剂之一，因其具有活性高、选择性强、对水稻和后茬作物安全以及可与其他作用机制除草剂混用等优点，并且兼具土壤封闭和茎叶处理效果，在我国稻田已有近30 年的使用历史[4-5]。由于苄嘧磺隆的长期使用，已导致该药剂对稻田多种阔叶杂草防效显著下降[6-7]。

ALS 抑制剂属于抗性风险较高的一类除草剂，连续单一使用容易使杂草对其产生抗药性[8]。截至2021 年7 月，全球已报道167 种杂草对ALS抑制剂类除草剂产生了抗性，约占到抗药性杂草总数 (522 例) 的三分之一[9]。我国稻田中主要阔叶杂草如雨久花Monochoria korsakowii、野慈姑Sagittaria trifolia、鳢肠Eclipta prostrata、丁香蓼Ludwigia prostrata、耳叶水苋Ammannia arenaria等均已对其产生不同程度的抗性[6-7,10-12]。杂草对除草剂产生抗性的机制主要有两种——靶标敏感性下降和代谢解毒能力增强。ALS基因突变导致除草剂与靶标酶结合能力下降，是杂草对ALS 抑制剂类除草剂产生抗性的主要机制[8]。目前，已明确ALS基因上的5 个保守区域共有8 个氨基酸位点的突变与对除草剂的抗性相关，分别是第122位丙氨酸 (Ala122)、197 位脯氨酸 (Pro197)、205位丙氨酸 (Ala205)、376 位天冬氨酸 (Asp376)、377 位精氨酸 (Arg377)、574 位色氨酸 (Trp574)、653 位丝氨酸 (Ser653) 和654 位甘氨酸 (Gly654)[9]。此8 个氨基酸位点上共报道了29 种突变类型，且在部分杂草中发现ALS基因上同时存在多个位点的突变，能够使杂草获得更高水平的抗性[13-14]。此外，由细胞色素P450、谷胱甘肽-S-转移酶、ABC转运蛋白等解毒酶介导的对ALS 抑制剂类除草剂的代谢抗性也已在多种抗药性杂草中被报道[15-17]。

目前，多花水苋在我国南方稻田为害日益严重，且部分地区苄嘧磺隆对其防治效果明显下降，推测多花水苋可能已对苄嘧磺隆产生了抗性，但目前尚无相关报道。为了明确江苏省多花水苋对苄嘧磺隆的抗性水平及抗性机理，本研究采用整株水平测定法，测定了采自江苏省扬州市水稻田的多花水苋疑似抗性种群 (YZ-R) 和相对敏感种群 (YZ-S) 对苄嘧磺隆的敏感性，分析了YZR 和YZ-S 种群多花水苋ALS 酶对苄嘧磺隆的敏感性差异，并对其靶标基因ALS进行了扩增和序列比对，以期初步探明其产生抗药性的分子机制，为多花水苋的抗药性治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 杂草 多花水苋Ammannia multifloraRoxb.疑似抗性种群 (YZ-R) 于2018 年10 月采自江苏省扬州市广陵区水稻田 (32.30° N；119.55° E)，已有约20 年的苄嘧磺隆用药历史；多花水苋相对敏感种群 (YZ-S) 于同年采自江苏省扬州市邗江区田边水沟 (32.40° N；119.43° E)，很少使用除草剂。所有种群均从至少20 株多花水苋植株上随机收集种子，在实验室自然晾晒风干，备用。

1.1.2 除草剂 10% 苄嘧磺隆 (bensulfuronmethyl) 可湿性粉剂 (WP)，江苏快达农化股份有限公司； 97%苄嘧磺隆原药，江苏绿利来股份有限公司。

1.1.3 生物试剂及主要仪器设备 植物Total RNA 提取试剂盒，宝日医生物技术(北京)有限公司；2 × Taq PCR MasterMix、普通琼脂糖DNA 回收试剂盒、Fast Quant RT Kit (with gDNase) 试剂盒，天根生化科技 (北京) 有限公司。GXZ 型智能光照培养箱，宁波江南仪器厂；3WPSH-5000 型生测喷雾塔，南京农业机械化研究所；5427R 型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；MK3酶标仪，美国Thermo 公司；Mastercycler Nexus Gradient 梯度PCR 仪，德国Eppendorf 公司；DYY-6C 型电泳仪，北京六一仪器厂；ChampGel 6000 全自动凝胶成像仪，北京赛智创业科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试材培养 将营养土与蛭石按等体积混合，装入7 cm × 7 cm × 7 cm 的塑料盆钵中，每盆用小毛笔点播至少32 粒多花水苋种子，上覆约0.1 cm 厚细土层，置于光照培养箱中培养 (光周期L/D：14 h/10 h；温度：白天35 ℃，夜晚30 ℃)。待幼苗生长至1 对真叶后间苗，每盆保留16 株长势基本一致的多花水苋植株。

1.2.2 多花水苋对苄嘧磺隆的抗性水平测定 采用整株水平测定法[18]。待多花水苋植株生长至2～3 对真叶期时，采用生测喷雾塔进行茎叶喷雾施药处理，设定喷液量为450 L/hm2，喷雾压力0.3 MPa。根据苄嘧磺隆的田间推荐剂量 (45 g/hm2，按有效成分计，以下同) 和预试验结果，确定苄嘧磺隆的处理剂量。其中，疑似抗性种群YZ-R 处理剂量分别为：0、2.81、11.25、45、180 和720 g/hm2；相对敏感种群YZ-S 处理剂量分别为：0、0.18、0.70、2.81、11.25、45 和180 g/hm2，以喷清水作为对照。处理后21 d，剪取并称量多花水苋地上部分鲜重，计算GR50值。每处理设3 个重复，试验重复2 次。

1.2.3 YZ-R 和YZ-S 种群ALS 酶对苄嘧磺隆的敏感性测定 多花水苋ALS 酶提取和离体活性测定参考Deng 等[14]和Yu 等[19]的方法。将YZ-R 和YZ-S 种群的多花水苋植株培养至3～4 对真叶期，分别剪取3 g 植株叶片，于 -80 ℃冰箱保存，备用。称取一定质量的苄嘧磺隆原药，溶于少量丙酮，用去离子水定容并按梯度稀释成系列浓度。酶活性测定反应体系中，苄嘧磺隆的系列终浓度分别为0、1.45 × 10-5、1.45 × 10-4、1.45 × 10-3、1.45 × 10-2、0.145、1.45、14.5 和145 μmol/L。每处理重复3 次，试验重复2 次。

1.2.4 YZ-R 和YZ-S 种群ALS基因的克隆和序列比对1.2.4.1 引物设计 根据NCBI 登记的拟南芥Arabidopsis thaliana(AT3G48560)、播娘蒿Descurainia Sophia(KC417457)、荠菜Capsella bursa-pastoris(HQ880660)、猪殃殃Galium aparine(GU377313) 及牛繁缕Myosoton aquaticum(KF589890) 等双子叶植物的ALS基因序列，在保守区域分别设计2 对引物 (表1)，用于扩增ALS基因，该扩增区域覆盖了ALS基因上已报道的全部8 个突变位点。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

表1 多花水苋ALS 基因扩增引物Table 1 Primers for the amplification of ALS gene in A. multiflora

1.2.4.2 总RNA 提取和cDNA 合成 待多花水苋植株生长至3～4 对叶期，分别单株收集YZ-R 和YZ-S 种群的幼嫩叶片组织，其中YZ-R 种群取10 株，YZ-S 种群取6 株，迅速用液氮处理后于-80 ℃冰箱保存。采用植物Total RNA 提取试剂盒提取总RNA，经1% 琼脂糖凝胶电泳分析RNA 降解程度，通过Nanodrop 检测RNA 的纯度并精确定量。使用反转录试剂盒进行RNA 的反转录，合成cDNA 第一条链，于 -20 ℃冰箱保存，备用。

1.2.4.3ALS基因序列扩增和测序 PCR 扩增反应体系为50 μL，包括：25 μL 2 × Taq PCR MasterMix，1 μL 正向引物 (10 μmol/L)，1 μL 反向引物 (10 μmol/L)，21 μL ddH2O 和2 μL cDNA模板。PCR 反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，重复35 个循环；最后于72 ℃ 延伸 5 min；4 ℃保存。得到的PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行PCR 产物回收后送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序。

以模式植物拟南芥的ALS基因氨基酸序列编号为标准，使用DNAMAN 6.0.3 软件分别对多花水苋YZ-R 种群和YZ-S 种群的ALS基因测序结果进行比对，分析ALS基因序列中8 个抗性相关位点是否发生了基因突变。

1.3 数据处理分析

采用SPSS 20.0 软件的单因素方差分析法对整株生物测定和离体酶活性测定的数据进行差异显著性分析。通过SigmaPlot 12.0 软件的双逻辑非线性方程 (1) 计算抑制杂草50%生长所需的除草剂剂量 (GR50) 和抑制其ALS 酶50%活性所需的除草剂浓度 (I50)；采用公式 (2) 计算抗性指数RI(resistance index)。

式中：x，苄嘧磺隆剂量 (g/hm2) 或浓度(μmol/L)；y，苄嘧磺隆不同剂量处理下鲜重与对照鲜重的百分比或不同浓度处理下ALS 酶催化活性与对照的百分比；C，剂量反应下限；D，剂量反应上限；b，在GR50或I50处的斜率。

2 结果与分析

2.1 多花水苋对苄嘧磺隆的抗性水平

由图1A 可以看出：在苄嘧磺隆1/16 田间推荐剂量 (2.81 g/hm2) 下，多花水苋敏感种群YZ-S植株的生长即受到严重抑制，主要表现为叶片黄化、生长停滞；而在苄嘧磺隆田间推荐剂量(45 g/hm2) 下，疑似抗性种群YZ-R 的生长虽受到一定抑制，但仍可继续完成其生活史。利用双逻辑非线性回归方程进行数据拟合，得到两个种群的剂量反应曲线 (图1B)。其中，YZ-S 种群的GR50值为1.61 g/hm2，YZ-R 种群的GR50值为65.28 g/hm2，表明多花水苋YZ-R 种群已对苄嘧磺隆产生高水平抗性，其抗性指数为40.6。

图1 苄嘧磺隆对多花水苋YZ-S 和YZ-R 种群的抑制作用 (A) 和剂量-反应曲线 (B)Fig. 1 Inhibition of bensulfuron-methyl to A. multiflora YZ-S and YZ-R populations (A) and dose-response curves (B)

2.2 YZ-R 和YZ-S 种群ALS 酶对苄嘧磺隆的敏感性

离体ALS 酶对苄嘧磺隆的敏感性测定结果见表2。未使用除草剂处理时，多花水苋YZ-R 和YZ-S 种群之间ALS 酶总催化活性无显著性差异；经苄嘧磺隆处理后，与YZ-S 种群相比，YZR 种群ALS 酶的敏感性显著下降，抗性指数为31.1。

表2 离体条件下多花水苋YZ-S 和YZ-R 种群ALS 酶对苄嘧磺隆的敏感性Table 2 In vitro sensitivity of ALS enzyme in YZ-S and YZ-R A. multiflora to bensulfuron-methyl

2.3 YZ-R 和YZ-S 种群的ALS 基因差异

将多花水苋YZ-R 和YZ-S 种群的ALS基因核苷酸序列与拟南芥的ALS基因核苷酸序列进行比对，结果 (图2) 表明：与YZ-S 种群相比，YZ-R种群ALS基因的第588 位碱基C 突变为T，导致其第197 位的脯氨酸 (Pro) 突变为丝氨酸 (Ser)；且在YZ-R 种群的10 株植株中都发生了Pro-197-Ser 突变。

图2 多花水苋YZ-S 种群 (6 株) 和YZ-R 种群 (10 株) ALS 基因部分核苷酸序列比对Fig. 2 Nucleotide sequence alignments of ALS gene fragment from YZ-S population (6 plants) and YZ-R population (10 plants)

3 结论与讨论

苄嘧磺隆于1986 年即开始在我国登记使用，可有效防除水稻田中绝大多数阔叶杂草和莎草，对水稻和后茬作物都十分安全。近年来，苄嘧磺隆主要与丙草胺 (pretilachlor)、苯噻酰草胺(mefenacet) 及二氯喹啉酸 (quinclorac) 等水稻田除草剂进行复配使用，以扩大杀草谱。由于苄嘧磺隆在水稻田的长期使用，已导致稻田多种杂草均对其产生了不同程度的抗药性。2009 年，卢宗志等[10]报道吉林省稻田2 个雨久花种群分别对苄嘧磺隆产生了6.0 和13.6 倍的抗性。2013 年，王兴国等[6]报道了浙江省不同稻区耳叶水苋对苄嘧磺隆的抗性，在88 个种群中发现有99.6%的种群已对苄嘧磺隆产生不同程度的抗性。2015 年，李平生等[20]报道辽宁省4 个野慈姑种群对苄嘧磺隆产生了12.48～76.99 倍的抗性。2021 年，Deng 等[12]报道江苏省1 个丁香蓼种群对苄嘧磺隆产生了21.18 倍的抗性。2021 年，汪涛等[21]报道辽宁省稻田9 个萤蔺Scirpus juncoides种群对苄嘧磺隆的抗性水平已高达48.66～106.83 倍。本研究中，多花水苋YZ-R 种群对苄嘧磺隆也产生了40.6 倍的高水平抗性，与文献报道中水稻田杂草对苄嘧磺隆的抗性趋势相符。

本研究对YZ-R 和YZ-S 种群多花水苋ALS基因分别进行测序分析后发现，YZ-R 种群植株的ALS基因发生了Pro-197-Ser 的氨基酸突变，并且该种群ALS 酶对苄嘧磺隆的敏感性相比YZ-S 种群亦出现了显著下降，抗性指数为31.1，但是YZ-R 和YZ-S 种群之间靶标酶ALS 的总催化活性并没有显著差异。这与前人关于播娘蒿[22]及硬直黑麦草Lolium rigidum[17]ALS基因上Pro-197-Ser 突变的研究结果一致，但也有研究发现，发生Pro-197-Ser 突变的抗性野萝卜Raphanus raphanistrum[23]和牛繁缕[24]的ALS 酶总催化活性显著高于敏感生物型。目前尚无证据表明，ALS酶总活性与突变类型及杂草种类等有关。本研究表明，抗性多花水苋ALS基因上发生 Pro-197-Ser 突变，使得ALS 酶的空间结构发生了变化，除草剂和靶标酶的结合能力随之减弱，从而导致多花水苋对苄嘧磺隆产生了抗性。

靶标基因突变是杂草对ALS 抑制剂类除草剂产生抗性的最主要机制[8]。ALS基因上发生Pro-197-Ser 突变导致杂草对ALS 抑制剂的抗性，已在对播娘蒿、猪殃殃、荠菜、鳢肠及莹蔺等多种杂草的研究中得到证实[21,25-28]。目前，在ALS基因上已报道的8 个抗性相关位点中，关于Pro197 和Trp574 位点突变的发现最多，分别在39 种和40 种杂草中已有相关报道[9]。ALS基因上不同位点的突变与除草剂类型、药剂选择压力和杂草适合度代价等因素有关，例如针对磺酰脲类除草剂容易筛选出Pro197 位点突变的抗性杂草，而针对咪唑啉酮类除草剂则更容易筛选出Trp 574 位点突变的抗性杂草[8]。此外，杂草单株中若同时发生两个靶标位点的突变，会导致其对除草剂产生更高水平抗性。张乐乐等[29]研究发现，荠菜ALS基因上同时发生Pro-197-Leu 和Trp-574-Leu 突变，导致其对苯磺隆的抗性水平达到了219.6 倍；而Xu 等[30]发现，播娘蒿ALS基因上Pro-197-Ala 和Asp-376-Glu 突变的同时发生，甚至使得该种群对苯磺隆产生了高达10 836.3 倍的抗性。

综上所述，本研究明确了水稻田杂草多花水苋对ALS 抑制剂类除草剂苄嘧磺隆产生高水平抗性的主要原因是其靶标基因ALS上发生了Pro-197-Ser 突变，该突变导致ALS 酶对苄嘧磺隆的敏感性显著下降。至于该苄嘧磺隆抗性种群是否对不同类型ALS 抑制剂如五氟磺草胺、双草醚等以及其他不同作用机理的除草剂存在交互抗性或多抗性，还有待进一步探讨。

杂草对除草剂的抗药性已成为当前农田草害治理的主要难题。抗药性杂草的出现，迫使农户不断提高除草剂用量，从而进一步增强了除草剂的选择压力，导致杂草抗药性水平不断升高。因此，在实际生产中，应注意将农业措施 (如水、旱轮作及稻田综合种养等) 与化学药剂防治措施相结合，同时科学选择并轮用或混合使用不同作用机制的除草剂，以有效控制杂草为害，延缓抗药性的发展。