椭圆叶花锚不同组分的提取与分离及体外体内抗氧化活性研究

顾秀琰 禚君 顾万红

甘肃省中医院，甘肃 兰州730050

椭圆叶花锚（Halenia elliptica D.Don）是龙胆科花锚属植物，以干燥地上部分入药，味苦，性寒，具有清热祛湿，疏肝利胆等功效［1-3］，为藏药“蒂达”的主要基原植物收载于《卫生部药品标准·藏药（第一册）》《藏药标准》《青海省中药材标准》中。蒙、彝、羌、傈僳等民族药中也在使用。椭圆叶花锚主产于青藏高原，分布较广，在藏、滇、川等省区皆产。2001 年被西藏红十字会与瑞士红十字会制定的《濒危藏药物种名录》列为三级濒危藏药［4-5］。本实验通过研究椭圆叶花锚不同极性提取物，体内外抗氧化活性，明确各有效部位活性差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 椭圆叶花锚全草（H.elliptica D.Don、H.cornpanulata）由甘肃省中医院闵云山主任药师，甘南林业技术服务中心杜平研究员共同鉴；DPPH（武汉艾克化学试剂公司，201503101），大鼠SOD ELISA 试剂盒（Dojindo 研究所），大鼠MDAELISA 试剂盒（Dojindo研究所）。

1.2 实验动物 SD 大鼠，体质量（200±20）g，雌雄各半，SPF 级，购自兰州大学实验动物中心，许可证号：SCXK（甘）2013-0002。雌雄分笼饲养，每笼5 只，自由饮水和进食，实验室观察7 天。

1.3 动物模型制备 大鼠正常饲养7d 后，随机分为空白对照组、模型对照组、高剂量组、低剂量组，每组20 只。除空白对照组外，其余大鼠附加高能量合剂（猪油15g、植物油15g、胆固醇7.5g、蔗糖15g、胆盐1g、奶粉8g、复合维生素0.5g、吐温8.5mL、丙二醇5mL，加蒸馏水至100mL），每天一次灌胃，连续30d，制备脂肪性肝炎大鼠模型。观察到大鼠行动迟缓、毛色晦暗、多数大鼠肝脏有不同程度的肿大或右肋下触痛敏感、进食量减少等体貌特征，即为模型制备成功。

1.4 方法

1.4.1 提取物的制备。取2kg 椭圆叶花锚药材，粉碎，置于圆底烧瓶中，先后加入8 倍量和6 倍量95%乙醇溶液，分别回流提取2h 及1h，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩，干燥，得到粗提物425g。将所得425g 提取物，加水定容至1000mL。置分液漏斗中，分别用等倍量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，合并各萃取液，减压干燥，分别得相应部位提取物：石油醚部位：21g、氯仿部位82g、乙酸乙酯部位95g、正丁醇部位70g、乙醇部位68g。取各提取物适量，加95%乙醇超声30min，制成相当于0.1g/mL 各溶液，放置4℃条件下备用。

1.4.2 DPPH 对照液的配制。精密称定DPPH 对照品10.0 mg，置于100mL 棕色量瓶中，95%乙醇充分溶解，定容，摇匀。即得为100μg/mL（0.2536mmol/L），DPPH对照贮备溶液，置-20℃冰箱中保存备用。临用前用95%乙醇稀释10 倍即得所需浓度对照液［6-8］。

1.5 各提取物体外抗氧化活性研究

1.5.1 溶液配制。总反应体积为3mL，将2mL DPPH 溶液分别加入试管中，分别取40μL、80μL、120μL、160μL、200μL 的待测溶液与一定量的95%乙醇至3mL，混匀后室温下避光静置30min，于517nm 处测定其吸光值Ai［9-12］。加样量见表1。

1.5.2 DPPH 自由基的清除能力评价方法。取2mL DPPH，1mL95%乙醇，于517nm 处测定其吸光值Ac。取40μL、80μL、120μL、160μL、200μL 的待测溶液与一定量的95%乙醇至3000μL，于517nm 处测定其吸光值Aj。Ai、Aj 每测一个不同量需要测3 个平行数据，而且在每测一个量的三个平行数据后都单测一次Ac。不同提取组分对DPPH 自由基清除能力（The percentage of scavenging radical capacity，SR%）的计算：SR%=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100%。Ai-提取组、DPPH 溶液、无水乙醇的吸光度；Ac-DPPH 溶液、无水乙醇的吸光度；Aj-提取组、无水乙醇的吸光度。

表1 样品加样量

1.6 体内抗氧化活性研究

1.6.1 给药方法。造模成功七天后开始给予药物干预。高剂量组（5g/kg）、低剂量组（1g/kg）分别将对应剂量的椭圆叶花锚黄酮提取物，混入粉碎的饲料中，压型烘干，饲养大鼠，连续15d；其余两组大鼠正常饲养。

1.6.2 大鼠血清SOD、MDA 含量的测定。给药结束后，所有大鼠再正常饲养7d 后，呼吸麻醉大鼠，股动脉采血（不加抗凝剂）约5mL，以转速3000r/min 离心10min，分离血清，按照试剂盒说明操作，检测大鼠血清中SOD、MDA 含量。

1.7 统计学方法 体外抗氧化实验数值用Excel 软件计算平均值和标准差，以（±s）表示，使用Dax1.0 软件，通过回归方程计算半抑制率。其余数据采用SPSS22.0 软件分析，数值以均数±标准差（±s）表示，选用双因素方差分析，SOD、MDA 含量测定组间采用单因素方差分析。组间比较采SNK 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组分DPPH 清除率 体外抗氧化实验重复3组，由待测样品浓度和抑制率所共同形成的回归方程得到半抑制率（IC50：当对自由基的清除率达到50%时，待测抗氧化剂的浓度），因此清除DPPH 自由基的半数清除浓度（IC50）可以用以表示抗氧化剂清除自由基的能力。IC50 值越小，表示抗氧化剂清除自由基的能力越强。由各部位标准曲线的回归方程可求得其半数抑制浓度IC50，可以看出乙酸乙酯部位具有较强的抗氧化活性。因此，椭圆叶花锚不同极性提取物对DPPH 自由基的清除率，在测定浓度范围内，均具有一定的抗氧化活性。其中乙酸乙酯提取物具有较高的抗氧化活性，石油醚部位主要是脂肪油和不饱和脂肪酸，而不饱和脂肪酸是导致氧化应激的物质之一，故抗氧化能力较弱。计算氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物对DPPH 的IC50，结果分别为0.42、0.31、0.61、1.1g/L。见表2。

表2 椭圆叶花锚各组分不同浓度对DPPH 清除作用（±s，n=3）

表2 椭圆叶花锚各组分不同浓度对DPPH 清除作用（±s，n=3）

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2.2 大鼠血清SOD、MDA 含量测定 与空白组比较，模型组SOD 值减少、MDA 值升高，提示模型大鼠的过氧化反应加速，肝细胞处于受损的变化状态，清除氧自由基的酶系能力降低，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，剂量组SOD 值升高，低剂量组组间差异有统计学意义（P＜0.05），高剂量组组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组MDA 值降低，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

清除DPPH 自由基法最早设立于上世纪末。DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在517nm 有强吸收。加入抗氧化剂时，其中的单电子与抗氧化剂配对生成其他物质，其颜色变浅，从而使DPPH 峰值处的吸光度变小，且吸光度的变化与DPPH 配对电子数存在定量关系，故可通过检测最大吸收波长处的吸光度，来评价反应自由基的清除能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。清除DPPH 法的优点是稳定性好，选择性强，快速，易重复，简单，灵敏，不需要复杂的仪器，所以在生产活动中大规模应用［13］。

表3 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清SOD 与MDA 的影响（±s）

表3 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清SOD 与MDA 的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

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本研究小组首先对椭圆叶花锚用不同极性的溶剂进行提取，通过体外DPPH 法评价椭圆叶花锚不同溶剂提取物清除自由基活性能力，结果显示石油醚提取物体基本无清除自由基能力，乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、乙醇提取物，在测定浓度范围内，均具有一定的抗氧化活性，且清除率与质量浓度呈正相关系。其中，椭圆叶花锚乙酸乙酯提取物具有较高的抗氧化活性，考虑石油醚部位主要是脂肪油和不饱和脂肪酸，抗氧化能力较弱。

通过进一步对椭圆叶花锚总黄酮提取物高、低剂量组，进行大鼠血清SOD、MDA 含量测定。研究发现，椭圆叶花锚总黄酮提取物，可以降低肝炎模型大鼠血清中MDA 含量、升高SOD 含量，具有较强的抗氧化能力，与体外抗氧化实验结果一致。

近年来，对椭圆叶花锚的研究大多集中在中药资源、化学成分、生物活性、药效药理及临床应用等方面。通过对椭圆叶花锚的高极性部位中进行提取，分离到一些具有新母核结构、双葡萄糖的口山酮苷以及一些只检测到，但至今未分离到的化合物。目前主要分离到的化合物包括：口山酮苷元、口山酮苷、香豆素类、甾醇、五环三萜类、黄酮苷元及其苷、裂环烯醚萜类、色原酮类、挥发油类等。而口山酮苷元及其苷是椭圆叶花锚中含量与种类最为丰富的化合物类型［14］。此类化合物大多极性较高，而这与乙酸乙酯提取物抗氧化活性最强的实验结果亦相对应。

对于椭圆叶花锚抗氧化作用，高洁等［14］对其全草乙醇提取物乙酸乙酯部位分离到的六个口山酮苷元进行了抗氧化研究，发现其分离到的提取物，抗氧化作用十分明显，强于经典抗氧化物维生素E［15］。

另外，本课题组亦通过动物实验发现，椭圆叶花锚总黄酮不仅可降低肝炎模型大鼠血清MDA 含量、升高SOD 含量，且可在一定程度上改善肝细胞受损程度。椭圆叶花锚通过其有效药物成分总黄酮作用于肝脏细胞，改善细胞功能，增强抗氧化酶系统在抗氧自由基中的作用来治疗肝炎［16］。

椭圆叶花锚还具有利胆、降血糖、降血脂、调节免疫功能、舒张血管、镇静、解痉、降低血压、减慢心率的作用；而其毒性试验、致畸试验均表明花锚安全性较好，在长期给药情况下，未表现出肝肾毒副作用。国外曾有报道指出倍半萜类化合物Halenin A 和Halenin B 具有一定的抗细菌和抗肿瘤活性作用［17］。由此可见，椭圆叶花锚值得进一步深入研究。

椭圆叶花锚在某些少数民族地方志如《滇省志》或少数民族用药记录里都有过记载如《民族药志一》《中国藏药》《怒江药》等。虽然用药地域有差别，记载有不同的名字，但是治疗范围都很相似，主要在肝胆疾病，而且记载中都有很好的效果。椭圆叶花锚全国分布广泛，生长环境在海拔400～4000 米。作为分布如此广泛的植物资源，传统中药典籍里却没有记载，都是某些地方志或民族用药记载，而且记载较多的地区集中在云贵川和西藏。从目前对椭圆叶花锚原植物的研究，也并没有发现有其亚种或变种，可能是因为环境、气候、海拔或土壤的成分造成了有效成分的差异，从而导致在临床疗效上出现重大的差异。目前国内在椭圆叶花锚上的研究也主要集中在植物资源、有效成分、药理及临床应用等方面，但迄今为止，尚未见到不同地区，不同环境，不同海拔，不同土壤下椭圆叶花锚的有效成分在含量上的差异研究。那么，在这种情况下，不仅无法进一步精确研究其临床疗效，而且对于野生椭圆叶花锚野生驯化，人工种植也无法确定合适的地域、气候与环境。作为中华民族民族用药的瑰宝之一，研究椭圆叶花锚不仅要不断完善质量标准，而且要促进人工野生驯化的研究，扩大中药来源，从而满足中药产业化开发要求。