高效液相色谱法测定复方黄蜀葵花喷雾剂中金丝桃苷含量*

谭本仁，黄义纯，陈华龙，郑锦坤，徐晓梅△

1 汕头大学医学院附属粤北人民医院,广东 韶关 512026；2 韶关市食品药品检验所

复方黄蜀葵花喷雾剂是以黄蜀葵花为主，配紫草、地榆、大黄、白及、虎杖、大黄等中草药，经过科学方法提取和研制而成，用于治疗各种烧、烫伤引起的创伤、疼痛、红肿、溃烂及感染等。黄蜀葵花具有清利湿热、消肿解毒功效，用于湿热壅遏，淋浊水肿，痈疽肿毒，水火烫伤［1-2］，其主要成分为金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、棉皮素-3-葡萄糖苷和异槲皮苷等黄酮类成分，收载于2015年版《中华人民共和国药典》［3-5］。其中，金丝桃苷具有抗炎、解痉、利尿、止咳、保肝、免疫调节等多种药理活性［6］。本研究采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定复方黄蜀葵花喷雾剂中主要成分金丝桃苷的含量，旨在为制定复方黄蜀葵花喷雾剂质量标准提供依据。

1 材料

1.1 仪器岛津（SHIMADZU）LC-30AD型高效液相色谱仪（日本岛津）；岛津SPD-20A型紫外分光检测仪（日本岛津）；METTLE TOLEDO AG135型电子天平（精密0.000 01 g）；HT-300BQ型超声波清洗仪（济宁恒通）。

1.2 试药复方黄蜀葵花喷雾剂样品及其阴性对照品均由汕头大学医学院附属粤北人民医院制剂室自制；金丝桃苷对照品（批号：111521-201809，含量：94.9%，中国食品药品检定研究院提供）；乙腈、甲醇（色谱纯，TEDIA公司）；水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Kromasil 100-5-C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；乙腈为流动相A，2%磷酸盐缓冲溶液为流动相B，梯度洗脱，流动相比例见表1。柱温：30℃；流速：1 mL/min；检测波长：401 nm，进样量：10μL。理论板数按金丝桃苷计算应不低于3000。

表1 梯度洗脱流动相比例

2.2 金丝桃苷对照品溶液的制备精密称取金丝桃苷对照品10.81 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作为102.58μg/mL的对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备精密量取复方黄蜀葵花喷雾剂供试品约10 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得。

2.4 阴性对照品溶液的制备按复方黄蜀葵花喷雾剂工艺制成缺黄蜀葵花的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

2.5 样品测定分别精密吸取对照品溶液、复方黄蜀葵花喷雾剂供试品溶液和阴性对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，复方黄蜀葵花喷雾剂中其他成分对金丝桃苷的测定无干扰。见图1—3。

图1 金丝桃苷对照品HPLC图谱

图2 供试品HPLC图谱

图3 阴性对照品HPLC图谱

2.6 线性关系考察取“2.2”项下对照品溶液，以对照品的含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。金丝桃苷的回归方程为：Y＝1.4065×103X+5.3507×103（r=1），结果表明金丝桃苷在10.26～205.17μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验分别精密吸取对照品溶液10μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，测定峰面积，并计算RSD为0.23%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验取复方黄蜀葵花喷雾剂，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样，测定金丝桃苷的峰面积，以考察供试品溶液的稳定性。结果RSD为0.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验取6支复方黄蜀葵花喷雾剂依“2.3”项下方法制备供试品溶液及进样测定含量，金丝桃苷的平均含量为18.35μg/mL，RSD为0.33%（n=6），表明重复性良好。

2.10 加样回收率试验精密量取6支复方黄蜀葵花喷雾剂供试品溶液10 mL，分别精密加入金丝桃苷对照品溶液（102.58μg/mL）0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并计算加样回收率。结果显示平均加样回收率为97.40%，RSD为0.81%（n=6），见表2。

表2 金丝桃苷加样回收率试验结果

2.11 样品中金丝桃苷含量测定取3批样品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，分别测定2次，结果表明复方黄蜀葵花喷雾剂中金丝桃苷含量基本稳定。见表3。

表3 金丝桃苷含量测定结果

3 讨论

3.1 提取溶液及提取方法筛选金丝桃苷作为复方黄蜀葵花喷雾剂的主要成分，可溶于甲醇［7］。在供试品溶液的制备过程中对甲醇、乙酸乙酯等不同提取溶剂进行优选，甲醇提取含量最高。选定甲醇为提取溶剂。在预试验中对比了超声、回流等不同提取方法，但差异性较小，所以采取直接提取方法。该法方便，快速，提取的金丝桃苷含量最高，确定本法为供试品溶液的制备方法［8］。

3.2 最大吸收波长测定取金丝桃苷对照品溶液和供试品溶液，进行紫外扫描，发现金丝桃苷在401 nm波长处有最大吸收，故本试验选择401 nm作为检测波长。

3.3 流动相、流速和柱温的选择考察了甲醇-水-磷酸系统、乙腈-水-磷酸系统［9］，乙腈-2%磷酸盐缓冲溶液的分离效果理想，确定为流动相系统。考察了0.8、1、2 mL/min 3个流速，结果1 mL/min流速效果最好。本分离系统在柱温30°条件下效果最理想。

综上所述，本试验首次建立了HPLC测定复方黄蜀葵花喷雾剂中金丝桃苷含量的方法，所建立的金丝桃苷测定方法简捷、快速、可靠，可用于复方黄蜀葵花喷雾剂的质量控制。