福州市动物园野生鸟类与周边活禽市场禽类H9 亚型低致病性禽流感病毒感染的监测与分析

那 洋 福州市动物园 福州 350012

依据禽流感病毒的致病性， 可分为低致病性禽流感病毒（LP-AIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。 低致病性禽流感通常不引起家禽大批量死亡，症候群一般为轻微的呼吸道症状或产蛋率下降，精神食欲不佳等[1]，但感染后常常引发免疫力下降，伴随继发、并发感染，这时病死率最高可达97%。 因此，低致病性禽流感对养殖业的危害不容忽视[2-3]。通过对高致病性禽流感流行病学的调查显示， 大多数传染源都来自野鸟或者水禽[3-4]。

PCR 检测原理：将由病毒RNA 反转的cDNA 作为模板，并设计出模板上的一段保守蛋白作为引物，DNA 在PCR 仪中呈指数增加。 若在后续电泳中出现引物的相应扩增条带，则为阳性。 多重PCR 技术的问世解决了禽流感多种亚型以及共感染鉴别检测复杂性的问题[5]。 多重PCR 是指在反应系统中加入多个引物， 可同时扩增出相应的核酸片段。 我国学者在前人研究基础上建立了禽流感病毒HA 与M基因的多重PCR 技术，可检测出目前已知的所有禽流感亚型，其灵敏性可检测低至1 ng 的RNA 水平[6-8]。

本试验对福州市动物园野生鸟类以及周边部分活禽市场禽粪便棉拭子取样， 进行H9N2 亚型禽流感病毒检测。 福州市位于低纬度沿海地区， 属于亚热带海洋性季风气候， 是大量鸟类迁徙路线的中转站，福州市动物园禽类种类繁多，常有救济站或迁徙途中受伤候鸟收养于园中；福州市区内人口基数大，畜禽混养，活禽市场众多，消费者与活禽接触密切。之前， 没有针对福州市动物园禽类低致病性禽流感病毒感染情况进行调查并将结果与周边活禽市场禽类检测情况进行对比。 本试验结果有助于动物园进行禽流感早期检测预防、 追踪低致病性禽流感的传染源及影响因素， 有助于动物园制定完善的防控措施。

1 禽流感样本采集

于2016 年10 月至11 月共计采样361 份，均为粪便棉拭子样品。 其中动物园采样共155 份， 包括9 目13 科23 种，具体种属及样本数量见表1；活禽市场采样206 份，主要为雁形目（Anseriformes）与鸡形目（Galliformes），包括77 份家鸭样品、98 份家鸡样品、31 份肉用雁鹅样品。

2 禽流感病毒M 基因RT-PCR 检测结果与病毒亚型鉴定

运用RT-PCR 对361 份粪便棉拭子进行检测，发现8 目127 羽份禽类携带禽流感病毒， 平均感染率为35.18%，动物园采样中鸽形目的病毒感染率最高（53.33%），其次为鸡形目（49.35%）。 活禽市场采样中雀形目的感染率最高（46.75%），其次为鸡形目（29.17%）。动物园中检出4 例H9N2 阳性，活禽市场所采样中暂未发现H9N2 亚型阳性。 各特异性引物RT-PCR 电泳结果见图1。

表1 动物园采样种属及数量

图1 各特异性引物阳性及阴性对照PCR 电泳图

将动物园采集的样品进行RT-PCR 检测，M 基因与H9 以及N2 亚型同时出现阳性条带， 判定为H9N2 亚型禽流感阳性，见图2。

将活禽市场采集的样品进行RT-PCR 检测，M基因与其他亚型同时出现阳性条带， 判定为相应亚型禽流感阳性，见图3。

图2 动物园采样RT-PCR 示例图

图3 活禽市场采样RT-PCR 示例图

病毒M 基因阳性鸟种与阳性率，见表2。

3 讨 论

表2 病毒M 基因阳性鸟种与阳性率

3.1 福州市动物园禽类AIV 传播趋势情况分析本研究主要针对动物园野生鸟类及周边活禽市场禽类低致病性禽流感病毒代表亚型H9N2 的感染情况进行调查。 共检测361 份粪便拭子，均为2016 年秋季取样。 采样种类较多、总体数量较少，但其结果基本能代表市区动物园野生鸟类和周边活禽市场禽类禽流感病毒感染情况。

目前所得128 例M 基因阳性样本中，动物园有4 例H9N2 亚型， 其中3 例为鸡形目； 活禽市场0例。 动物园与活禽市场最高两目禽的感染率对比见图4。 推测原因为野生雉鸡的生活及觅食习性与动物园饲养环境相近， 导致低致病性禽流感病毒更易携带、传播；周边活禽市场的家禽主要来自规模化养殖场，携带病毒的可能性较小。

图4 禽类感染率最高及次高柱形比较图

3.2 本地区动物园禽流感传播风险与防控措施从流行病学检测结果分析， 本地区动物园内禽流感阳性率高于同种类全球平均阳性率。 据以往病例分析，近年来未发现动物园内禽类禽流感死亡病例，但偶发性出现低致病性禽流感相应临床症状， 与本次调查结果相符。 低致病性禽流感虽较少引起大批量死亡现象，但容易与其他病原共感染。

现有调查数据显示， 周边活禽市场禽的低致病性禽流感感染率小于动物园内现有的禽类， 因此推测动物园的主要传染源有可能来自迁徙候鸟、 救助站救助的野生禽类。 建议对动物园内现有禽类进行迁徙候鸟保护措施，密切检测“非法入境者”，对被救助禽类进行全面隔离和检测[9-10]。

鉴于此次调查范围较小，也未对RT-PCR 结果进行测序， 不能完全推测该地区禽流感病毒感染情况、流行株基因遗传特征及流行演变趋势。拟进行后续研究， 将测序结果在NCBI 数据库Genbank 进行同源性比对，不同时间、季节采样，扩大采样数量，深入进行流行病学调查。将园内现有野生禽类保护好，真正做到防患于未然， 发挥流行病学监测的预防与预警作用。