牡丹江三道关林场大林姬鼠肠道菌群与功能预测

周思宇， 苏航 ，杨文建， 万祥旭 ，于成文， 金志民

(牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157011)

大林姬鼠是一种小型鼠类,属于脊索动物门，哺乳纲，啮齿目，鼠科，姬鼠属，又叫林姬鼠。广泛栖息于多种野外林区生境，在林区和农田中都比较多见[1]。吻部圆钝，耳朵外露，头部和背部毛色一致[2]。多在夜间活动，日间活动较少。以食用植物种子果实为主，对食物资源有掩埋行为[3-4]。

大林姬鼠属哺乳动物，其肠道内有数百种有益于健康的微生物[5]。鉴于肠道菌群对动物健康的重要作用，它被认为是哺乳动物的一个新“器官”[6-7]。肠道微生物在营养消化吸收、肠道健康和免疫等诸多方面发挥着重要作用，是动物生存和适应环境的关键[8]。大量研究表明，哺乳动物肠道疾病的发生与肠道微生物的结构密切相关[9-11]。本研究通过微生物测序技术对，为啮齿动物在复杂的林区中共存的适应机制提供数据，为农林有害微生物的防治、啮齿动物消化系统功能、实验室饲养野生动物的深入研究提供了基础的微生物数据，对鼠害防控有着重要意义。

1 材料和方法

1.1 样品的采集与保存

采用笼捕法，在牡丹江市三道关林场(地理位置位于黑龙江省牡丹江市的西北部，张广才岭安纺山脉之末，具有丰富的动植物资源，林场中心坐标为129°41′E,44°20′N)内采集，筛选优良活跃成年大林姬鼠个体雌雄各5只(表1)。样本带回实验室静止放置 30 min 让其情绪稳定后，在无菌条件下，迅速将鼠脱颈处死，小心地将鼠的肠道取出，立即放入装有液氮的研钵中速冻，装入2 mL无菌冻存管中，标记好后保存在-80℃冰箱，每只样本全部操作流程控制在2 min内完成。

表1 雌、雄样品编号

1.2 样本总DNA的提取

采用CTAB/SDS方法，对肠道组织进行总DNA的提取，经过1.8 %琼脂糖电泳20 min检测有明亮条带为提取成功。用无菌水把DNA稀释为1 ng/μL。使用通用引物对16SrRNA基因V3-V4区进行扩增(通用引物为：上游引物515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3',下游引物806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。在HiSeq 2500 PE 250 平台对纯化的产物进行双端测序。将所得到的样本数据进行处理，确定嵌合体部分并筛除该部分序列。

2 结果与分析

2.1 样品中有效序列和OTU数目

此次研究通过高通量测序技术对10份样品便进行 16S rRNA 测序。共获得有效序列508 269条，平均每个样品中含有50 827条有效序列，其中雌性具有245 311条，雄性含有262 958条。基于相似度>97%的原则，将获得的有效tags序列进行聚类，共获得693个OTUs，平均每个样品含有69个OTUs。其中，有效序列数量最高的是SDGDL2有58 752条有效序列，最低的是SDGDL1有43 398条有效序列，二者相差15 354条。韦恩图中重叠部分为所有样品共有的OUT数目，由图1可知10个样品中共有581个OTUs。

图1 雌性和雄性大林姬鼠OTUs韦恩图

2.2 Alpha多样性分析

根据OTU数据绘制了稀疏性曲线如图2，当测序深度增加曲线达到平缓，说明增加测序深度不能发现新的特征序列，测序具有合理性。有效反映了大林姬鼠肠道微生物菌群的多样性。Alpha多样性指数如表2所示，Ace指数范围408.74～556.71，Chao1指数范围441.58～560.07，Shannon指数范围4.45～6.35，Simpson指数范围0.87～0.97。

表2 雌、雄大林姬鼠肠道微生物Alpha多样性指数

图2 雌、雄大林姬鼠样本的稀释性曲线

2.3 物种相对分布

2.3.1 门分类水平上的组成。各样品在门水平的丰富度见图3，雌、雄大林姬鼠的肠道菌群Top5的优势门类分别为，厚壁菌门Firmicutes(雌55.264%，雄43.321%)、拟杆菌门Bacteroidetes(雌23.231%，雄19.920%)、Epsilonbacteraeota(雌8.608%，雄15.166%)、变形菌门Proteobacteria(雌6.641%，雄7.189%)，但雌性大林姬鼠第五大优势门类为Patescibacteria所占比例为1.740%，而雄性大林姬鼠第五大优势门类为柔膜菌门Tenericutes，占比6.475%。通过对比发现，雌、雄大林姬鼠前四大优势门类种类相同但所占比例各不相同，且第五大优势门类雌性为Patescibacteria，雄性为Tenericutes。由此可见，不同性别大林姬鼠肠道内的各类菌群在门水平上存在比例上的差异。

图3 雌、雄大林姬鼠肠道菌群门水平上丰度图

2.3.2 属分类水平上的组成。各样品自属水平上的丰富度见图4，在雌性大林姬鼠肠道菌群Top5中第一大优势菌群为Lactobacillus占比18.955%、第二大优势菌群为unidentified_Lachnospiraceae占比9.931%、第三大优势菌群为螺杆菌属Helicobacter占比8.608%，第四大优势菌群为unidentified_Muribaculaceae占比8.246%，第五大优势菌群为毛螺菌科NK4A136组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)占比7.940%；在雄性大林姬鼠肠道菌Top5中第一大优势菌群为螺杆菌属Helicobacter占比15.166%、第二大优势菌群为毛螺菌科NK4A136组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)占比13.562%、第三大优势菌群为unidentified_Muribaculaceae占比10.656%、第四大优势菌群为unidentified_Lachnospiraceae占比9.674%、第五大优势菌群为乳酸菌属Lactobacillus占比5.845%。由此可见，不同性别的大林姬鼠肠道内的各菌群在属水平上存在比例上的差异。

图4 雌、雄大林技术肠道菌群属水平上丰度图

2.4 雌、雄大林姬鼠heatmap图分析

图5是基于weighted-UniFrac 的样品距离heatmap 图。从图中可以看出，大林姬鼠的雌性和雄性肠道内的微生物菌群没有明显的差异。

图5 雌、雄大林姬鼠肠道菌群丰度热图

2.5 功能预测

PICRUSt软件中比对16S测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成，从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异。KEGG通路分析预测出很多基本代谢功能基因，主要涉及的在一层功能层级上的6类代谢通路为：有机系统、代谢、人类疾病、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程，其中代谢、遗传信息和环境信息处理为主要的3类通路。在二功能层水平共注释到43个代谢功能，功能丰度见图6，丰度高于1%的前3个代谢功能是Global and overview maps(雌41.099%,雄41.820%)、碳水化合物代谢Carbohydrate metabolism(雌9.800%，雄9.190%)、氨基酸代谢Amino acid metabolism(雌6.108%，雄6.368%)。在雌性大林姬鼠中第四位功能为膜转运能量代谢Membrane transport占比4.088%，第五功能为核苷酸代谢Nucleotide metabolism占比4.037%；在雄性大林姬鼠中第四功能为能量代谢Energy metabolism占比4.125%，第五功能为辅助因子和维生素的代谢Metabolism of cofactors and vitamins占比4.034%。

图6 雌、雄大林姬鼠KEGG功能预测

3 讨论

肠道菌群主要的作用是帮助宿主分解食物和获取营养，特别是体内有益菌帮助宿主提高蛋白质、糖及维生素等的获得量，增强宿主对食物的利用，在动物的不断进化中，食物资源、动物、微生物的生存相互影响，在食物不足时，不适应环境的个体会被淘汰。在林区复杂环境下，食物资源会随着季节而发生改变，动物的肠道菌群也会伴随着改变，本实验为了排除季节的影响，所以只研究食物资源较丰富的秋季，在鼠类的肠道菌中常见的有益菌为厚壁菌门中的乳杆菌和拟杆菌门中的双歧杆菌，在本次调查中，大林姬鼠的肠道菌群中包括潜在益生菌有乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)等乳酸菌，但是在本次调查中没有检测到双歧杆菌的存在，这可能是啮齿动物在秋季主要食用植物种子的原因，体内其他菌占据优势或食物组成的菌群对双歧杆菌有抑制作用，也有可能是地理环境的原因，具体的影响机制仍需研究。