不同线栓法复制局灶性脑缺血模型大鼠恢复期学习记忆能力的差异及其机制

缪培，张通，米海霞，张伟东

1.首都医科大学附属北京潞河医院，北京市 101199；2.中国康复研究中心北京博爱医院，北京市 100068；3.首都医科大学康复医学院，北京市 100068；4.国家卫生健康委员会保健局，北京市 100044

0 引言

脑卒中是最常见的严重神经系统疾病，约88%是缺血性脑卒中。实验动物模型为研究缺血性脑卒中的病理生理过程提供了重要手段[1]。

大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlu‐sion,MCAO)模型是目前最常用的模拟人类脑梗死的实验动物模型。制备MCAO模型的方法很多，如光化学法、三氯化铁法、线栓法、自体血栓法、电流损伤法、自发性MCAO 等[2]。Zea Longa 线栓法[3]具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血时间等优点，是目前应用最广泛的方法。根据线栓保留时间，可分为永久性脑缺血模型和脑缺血再灌注模型，分别模拟没有再灌注的脑梗死和血管再通的脑梗死[4]。探讨不同模型大鼠功能预后，对选择实验动物模型十分重要。

既往比较不同MCAO大鼠模型间差异的研究主要集中于急性期，观察指标局限在梗死体积和病理生理方面[5-9]。脑梗死会出现长期感觉运动功能和认知功能障碍，慢性期的研究也非常重要；对实验性脑梗死动物模型长期预后的研究主要集中于感觉运动和认知功能方面[10]。也有学者探讨不同MCAO 模型间恢复期差异，主要集中于行为学方面，且均非线栓法[11-12]。

局灶性脑缺血大鼠存在自发恢复[13]，探讨脑梗死动物模型在自发恢复过程中的认知功能变化，对评估药物或康复策略的长期效果很有必要。

弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)利用水分子在不均质组织中的扩散具有各向异性特征进行成像，最常用的参数是各向异性分数(fractional anisot‐ropy,FA)[14]。

本研究比较永久性缺血和缺血再灌注大鼠模型在自然恢复状态下认知功能恢复的差异，并分析DTI 相应感兴趣脑区的FA，为选取理想的局灶性脑缺血大鼠模型进行相关实验研究提供参考；同时探讨功能恢复与脑结构变化的关系，为预测脑梗死功能恢复提供临床参考。

1 资料与方法

1.1 实验动物

成年雄性Sprague-Dawley 大鼠21 只，体质量250～280 g，SPF 级，饲养于北京友谊医院实验动物部动物屏障实验室，许可证号SYXK(京)2012-0023。

本研究已经首都医科大学动物试验伦理审核(No.AEEI-2014-132)。

1.2 模型制备

将大鼠随机分为假手术组(n=7)、永久性缺血组(n=7)和缺血再灌注组(n=7)。禁食水12 h。

永久性缺血组以10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台上，颈部正中切口，钝性分离暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉分岔处，结扎颈总动脉及颈外动脉近心端，动脉夹临时夹闭颈内动脉，于颈总动脉远心端做一切口，插入相应直径的硅胶头线栓，使其沿颈总动脉进入颈内动脉，到达大脑中动脉起始部，有轻微阻力感时停止，深约1.8～2.0 cm。固定线栓，检查无出血后缝合切口。每天皮下注射生理盐水5 mL补液，连续3 d。

缺血再灌注组基本操作同永久性缺血组，插入线栓后开始计时；固定线栓，缝合颈部皮肤，使栓线尾端暴露于皮肤外；90 min 后再次麻醉大鼠，拆除颈部皮肤缝合线，拔出栓线；缝合颈部皮肤。

假手术组仅暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉分岔处后，缝合切口。

手术过程中保持室温＞25 ℃。术后予电热毯保暖，维持肛温(37±0.5)℃。予充足的食物和水。

1.3 纳入标准

造模后参照Longa 评分标准[3]评分：0 分，无神经功能损伤症状；1分，不能伸展对侧前爪；2分，向对侧转圈；3 分，向对侧倾倒；4 分，不能自发行走；5分，意识丧失。1～3分纳入实验。所有大鼠均纳入。

1.4 Morris水迷宫

Morris 水迷宫(安徽正华生物仪器设备有限公司)直径170 cm，高50 cm，水池内壁漆为黑色，水温(23±1)℃。室内光照恒定，无光线反射在池内。将水池分为四个象限，第一象限正中距离池壁35 cm 处放直径9 cm、高35 cm 的圆形平台，平台顶低于水面1 cm，水池中倒入墨水掩盖平台。水迷宫上方摄像机同步记录大鼠运动轨迹。训练期间，水迷宫外参照物保持不变。

1.4.1 定位航行实验

大鼠从术后16 d 开始，于每天上午8:00～11:00 训练4 次，共6 d。依次选择4 个象限作为入水点，将大鼠面向池壁放入水池，同一次训练所有大鼠入水点相同。如大鼠在水中游泳一段时间后爬上站台，并在站台上停留时间超过3 s，认为大鼠找到站台，系统记录大鼠在水中游泳时间，为逃避潜伏期。如大鼠90 s 内未找到平台，人为将其引导上平台，潜伏期记为90 s；大鼠爬上平台或被引导上平台后，让其在平台上休息10 s。取四次训练的平均值。第1 天训练为适应性训练，不计入统计。

1.4.2 空间探索实验

训练第7天(术后22 d)撤除平台，将大鼠从第三象限面向池壁放入水中120 s。记录其第一次到达平台所在位置时间(潜伏期)，在各象限的游泳路程、时间、速度，以及大鼠在站台周围活动路程、时间、游泳路径。计算平台象限与边界游泳路程比和时间比。

1.5 DTI

术后22 d，各组选Longa 评分相近的4 只大鼠，采用PharmaScan 7.0 T MRI 扫描仪(德国BRUKER BIOSPIN 公司)进行扫描，包括定位图、T2WI、T2map及DTI。定位图采用RARE序列，层厚1 mm，扫描层数8 层，TR 2000 ms，TE 32.2 ms，偏转角180°，视野330×330 mm，矩阵256×256；T2WI 采用RARE 序列，层厚0.7 mm，扫描层数30 层，TR 5000 ms，TE 36 ms，偏转角180°，视野330×330 mm，矩阵256×256；DTI 采用SE-EPI 序列，弥散敏感梯度为非共线且非共面的30 个梯度方向，b=1000 s/mm2，同时包括5 个b=0 s/mm2的DTI 图像，层厚0.7 mm，扫描层数30 层，TR 7500 ms，TE 25 ms，偏转角90°，视野330×330 mm，矩阵256×256，相位编码方向为从左到右，平均激励次数4次。

数据由同一实验人员在工作站采集，选T2WI 显示缺血灶面积最大的层面，在病灶侧选缺血皮质区和纹状体区面积1 mm2的感兴趣区；以冠状位为轴，在对侧相应位置取相同面积感兴趣区。测定感兴趣区FA，计算病灶侧与对侧比值(rFA)。

选T2WI海马层面，选取病灶侧海马区面积1 mm2感兴趣区，以冠状位为轴，在对侧相应位置取相同面积感兴趣区。测定感兴趣区FA，计算rFA。

采用Image J 软件分别划取大鼠各层面脑梗死区域，计算脑梗死体积和梗死体积比。

1.6 统计学分析

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析。计量资料以()表示，若符合正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析或独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用秩和检验；多组重复测量数据比较采用重复测量方差分析。大鼠感兴趣区有显著性差异的DTI参数与有显著性差异的认知功能相关指标行Spearman相关分析。显著性水平，秩和检验采用校正α=0.017，其余检验α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

2.1.1 定位航行实验

三组逃避潜伏期均随训练时间增加呈下降趋势，永久性缺血组无显著性差异(P＞0.05)，但永久性缺血组第3天、第5天时潜伏期小于第1天(P＜0.05)。

组间比较，永久性缺血组各时间点逃避潜伏期均大于假手术组和缺血再灌注组(P＜0.05)。缺血再灌注组与假手术组相比无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组定位航行实验逃避潜伏期比较 单位：s

2.1.2 空间探索实验

三组平台象限时间比、距离比无显著性差异(P＞0.017)；永久性缺血组和缺血再灌注组边界时间比和距离比大于假手术组(P＜0.017)，永久性缺血组潜伏期大于假手术组(P＜0.017)。三组平均速度值无显著性差异(P＞0.017)。见表2。

2.1.3 游泳路径

假手术组和缺血再灌注组探索轨迹趋向性、目的性更强，主要集中于水池内部，永久性缺血组路径集中于周边。见图1。

图1 三组游泳路径

2.2 DTI

2.2.1 皮质

皮质左侧(患侧)FA 和rFA 由小到大依次为永久性缺血组＜缺血再灌注组＜假手术组(P＜0.05)。三组间右侧FA无显著性差异(P＞0.05)。见表3。

表3 三组皮质感兴趣区FA及rFA值比较

2.2.2 纹状体

纹状体左侧FA 由小到大依次为永久性缺血组＜缺血再灌注组＜假手术组(P＜0.05)。rFA 由小到大依次为永久性缺血组=缺血再灌注组＜假手术组(P＜0.05)。三组间右侧FA无显著性差异(P＞0.05)。见表4。

2.2.3 海马

三组间海马左侧、右侧FA和rFA均无显著性差异(P＞0.05)。见表5。

表5 三组海马感兴趣区FA及rFA值比较

2.2.4 梗死体积

永久性缺血组梗死体积和梗死体积比明显大于缺血再灌注组(P＜0.01)。见表6。

表6 两组梗死体积比较

2.3 相关性分析

逃避潜伏期、边界时间比和距离比与皮质和纹状体左侧FA、rFA 均相关(P＜0.05)。水迷宫测试的潜伏期和边界时间比与梗死体积和梗死体积比均相关(P＜0.05)。见表7。

表7 DTI参数与Morris水迷宫相关参数的相关性分析

3 讨论

Morris 水迷宫是用来评定局灶性脑缺血大鼠空间学习能力和记忆能力的常用方法[15-17]，逃避潜伏期代表动物空间学习能力。本研究显示，永久性缺血模型和缺血再灌注模型大鼠学习能力均有损伤，缺血再灌注大鼠损伤较轻。

空间探索实验中，大鼠寻找平台所在位置的游泳策略是衡量动物分析判断能力和解决问题能力的指标。正常大鼠随着训练次数增加，游泳轨迹更有趋向性和直线性，目的性较强，而痴呆大鼠可能更趋向于边缘性和随机性。本研究显示，永久性缺血模型大鼠游泳路径属典型的边缘式，提示认知损伤较重。三组大鼠平均速度基本相同，可排除速度对结果的影响。与Roof等[11]的结果一致，永久性脑缺血大鼠学习记忆能力损伤持久而严重。

DTI 通过改变扩散敏感梯度方向，测量体素内水分子在各个方向上的扩散强度[14]，FA指各向异性部分与总扩散张量之比[18]，主要反映脑组织神经纤维的多少、排列方向的一致性及纤维束完整性，可用于评价组织结构完整性、病理改变及组织结构和功能关系[19],临床应用最为广泛。

大鼠MCAO模型造成纹状体及额顶颞叶、部分枕叶等区域损伤，丘脑、下丘脑、黑质等部位也会出现不同程度损伤[20-21]。脑梗死后，由于梗死区白质和灰质结构小梁破坏，急性期和亚急性期FA 减小[22]。慢性期，FA 可能增加，可能与运动和神经功能恢复有关；也可能随着缺血持续，血管源性水肿、细胞膜碎裂、细胞坏死，结构小梁破坏，导致FA 持续降低[23]。本实验中模型大鼠患侧皮质、纹状体区FA和rFA均明显下降，可能反映皮质、纹状体区细胞结构和髓鞘结构的破坏，神经纤维完整性降低；缺血再灌注大鼠患侧皮质、纹状体区FA、rFA 较永久性缺血大鼠增高，可能与再灌注大鼠早期恢复血流，半暗带血供改善，细胞坏死减轻有关[24]。右侧皮质、纹状体区FA 和rFA均无显著性差异，提示对侧皮质纤维结构无明显损伤。

本实验中，三组大鼠双侧海马区FA、rFA 均无显著性差异，主要由于海马的血供主要是由大脑后动脉分支供应，少部分由颈内动脉发出的脉络膜前动脉供应，因此MCAO 并不会引起海马缺血改变[25]。有研究显示[26]，海马改变可能与脑梗死后，周围皮质形成的扩散性抑制波有关：扩散性抑制波会引起皮质释放过量谷氨酸，过量的谷氨酸顺突触传递到同侧海马，引起同侧海马神经元兴奋性中毒和环氧化酶2 升高，进而引起海马炎症反应和神经元凋亡。海马与学习记忆能力密切相关[27]。两种模型大鼠均出现与海马相关的学习记忆能力受损，可能与海马区炎症反应和神经元凋亡有关，也可能与皮质、纹状体区与海马区之间的神经通路受损有关[28]。有研究显示[29]，皮质或纹状体损伤与Morris 水迷宫学习记忆能力受损有关，与本研究一致。

缺血侧大脑半球距嗅球尖端7～11 mm 矢状裂至外侧裂下2/3 皮质组织仅由大脑中动脉供血，大鼠MCAO 模型时梗死出现早而完全，可代表缺血中心区；上1/3 皮质组织由大脑前动脉和中动脉双重供血，缺血较轻，表现为半暗带变化[30]；缺血再灌注后主要恢复半暗带区血流，在灌注时间窗内恢复血流可减少梗死体积。缺血后恢复再灌注时间越长，梗死体积越大[31]。本研究显示，缺血再灌注大鼠梗死体积较永久性脑缺血大鼠缩小，与既往研究结果一致[31-32]。

相关性分析显示，学习记忆能力与脑梗死大鼠患侧皮质、纹状体区FA、rFA 相关，这与汤翔宇等[33]的研究一致。有学者认为，脑梗死体积与大鼠神经功能缺损有一定相关性，可将梗死体积变化作为评估大鼠预后的指标[24,32]。

综上所述，永久性脑缺血和缺血再灌注模型大鼠均会出现学习记忆功能障碍，可能与缺血区神经纤维结构破坏、缺血区血管源性水肿，以及皮质、纹状体区与海马未缺血区纤维联系断裂等相关。严重的认知功能障碍只出现在永久性脑缺血大鼠模型中，缺血再灌注大鼠认知功能损伤较轻，可能与缺血皮质、纹状体区神经纤维结构更加完整、梗死体积更小有关。恢复期脑损伤区域FA 增加、梗死体积变小，可能为功能恢复良好的有效预测指标。

本研究样本量偏小，还需进一步研究验证。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。