甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留检测方法研究进展

郭芫君，黄 茜，王 鸟，占如意，陈露婷，郝香兰，孟信刚

（1.景德镇学院生物与环境工程学院，江西景德镇 334000；2.景德镇市卫生学校，江西景德镇 333000；3.六盘水生态环境监测中心，贵州六盘水 553000）

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是用天然抗生素Strobilurin A为先导物开发的新型杀菌剂。该类杀菌剂的作用包括防治多种作物病害、清除多种病害的病原菌，有低毒、广谱性、内吸性、高活性等特点[1]，活性基团为甲氧基丙烯酸（酯/酰胺），作用机理是阻挡电子传递，抑制线粒体呼吸，进而抑制真菌生长，对大多数真菌性病害具有较好的防治效果[2-3]，适用草坪及蔬菜、水果、谷类、核果类等植物[4]。该类杀菌剂是全球销量额最高的杀菌剂[5]，2014年销售额为37.43亿美元[6]，在我国销量也十分巨大[7]，但研究发现这类杀菌剂对环境和生物有负面影响，主要为农作物表面的农药残留难以清除[8]，并对哺乳动物、土壤生物群落存在一定生态毒性[9-11]。其对环境、生物及人类的危害需进一步深入研究，因此，掌握其检测方法是十分有必要的。笔者通过查阅标准、科研文献等资料，阐述该类杀菌剂的种类、残留量、检测方法，以期为该类杀菌剂检测技术的改进和解决该类杀菌剂残留问题提供参考。

1 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的种类及其残留限量

1969年，科学家MUSILEK等发现了抗真菌活性的物质，并将其命名为Strobilurin A。以后，科学家们又研发出系列用Strobilurin A为先导物的杀菌剂，主要种类有吡唑醚菌酯、吡唑嘧菌酯、E-苯氧菌酯、Z-苯氧菌酯、丁香菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、醚菌胺、醚菌酯、嘧菌胺、嘧霉胺、嘧菌酯、嘧螨酯、烯酰吗啉、烯肟菌酯、肟菌酯、肟醚菌胺、肟嘧菌胺、唑菌胺酯等（图1）。伴随甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的大量应用，接踵而至的残留问题引起世界各国的重视，很多国家或国际组织制定了该类杀菌剂残留限量条例。我国在《食品安全国家标准——食品中农药最大残留限量》[12]中也对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在谷物、油料或油脂、蔬菜、水果等农产品种类中明确规定，如啶氧菌酯在稻谷中的最大残留限量为0.20 mg/kg，在黄瓜中的最大残留限量为0.50 mg/kg，在葡萄中的最大残留限量为1.00 mg/kg；嘧菌酯在柑橘中的最大残留限量为1.00 mg/kg，在莲藕中的最大残留限量为0.05 mg/kg，在玉米油中的最大残留限量为0.10 mg/kg；醚菌酯在小麦中的最大残留限量为0.05 mg/kg，在香蕉中的最大残留限量为0.50 mg/kg。目前，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在水和土壤中的残留限量值主要参照各类作物上的残留限量值。

图1 甲氧基丙烯酸酯类几种具有代表性的杀菌剂

2 农产品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的检测方法

2.1 气相色谱法在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检测中的应用

气相色谱法（gas chromatography，GC）是色谱法的一种，常用于农药残留检测，多采用电子捕获器（ECD）和氮磷检测器（NPD）[13]。在气相色谱法检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留相关文献中，样品为含有大量色素、维生素、糖类、水分等物质的柑橘、番茄、黄瓜等农产品，为去除这些物质和水分需对样品进行前处理（提取、分层、净化），采用有机溶剂（乙腈、乙酸乙酯-环己烷）提取，氯化钠、无水硫酸镁等吸收水分。如吴洁珊等[14]对柑橘样品经乙腈提取盐析，固相萃取小柱净化，使用HP-5MS毛细管柱分离，GC-ECD检测，结果表明，醚菌酯、肟菌酯、唑菌胺酯和烯肟菌酯在含量范围内线性关系良好，相关系数分别为 0.999 4、0.999 3、0.999 6、0.999 4；章虎等[15]对番茄、黄瓜样品进行乙腈提取盐析，氟罗里硅土柱净化，使用Varian VF-5MS柱，GC-ECD检测，结果表明，醚菌酯、肟菌酯线性关系良好，相关系数分别为0.999 4、0.999 8；薄海波等[16]对西兰花、荷兰豆样品进行乙酸乙酯、环己烷萃取，无水Na2SO4脱水，GC-NPD结果表明，嘧菌酯在西兰花、荷兰豆中的检出限分别为0.005、0.010 mg/kg。对不同添加浓度进行分析，测定添加回收率判断气相色谱法的准确度。以上试验表明添加浓度多数大于0.01 mg/kg，添加回收率在75.0%～110.0%，符合添加浓度对回收率的要求；相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）也均小于 15.0%（表 1）。

表1 气相色谱法在检测农产品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的应用

2.2 气相色谱-质谱联用仪在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检测中的应用

气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留相关文献中，样品为食用菌类及大米、番茄等农产品，食用菌和大米含有大量的蛋白质、淀粉、脂类等，所含基质较为复杂，前处理方法可采用QuEChERS提取法和快速溶剂萃取法。在试验过程中也可对吸附剂的选择进行优化[17]，如范良彪等[17]研究对比了C18、石墨化碳黑（GCB）和PSA 3种吸附剂的净化效果，结果表明，C18、GCB吸附作用明显但回收率偏低；PSA吸附剂对杀菌剂吸附较少且能较好地去除基质效应，检测准确度高，所以选择PSA作为分散固相吸附剂；还对吸附净化剂配比与用量在试验中采用正交设计法进行了优化，如徐鹏等[18]以回收率为指标，采用正交设计三因素（GCB、C18、PSA）三水平，确定了吸附净化剂的配比及用量为：GCB加入量为25 mg、PSA加入量为200 mg、C18的加入量为150 mg。研究人员还对质谱条件进行了优化，如郑兆姗等[19]根据待测化合物保留时间和相应的质谱图，确定了选择性离子检测（selected ion monitor，SIM）分析条件，吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、醚菌酯、嘧菌酯、肟菌酯的保留时间分别为7.30、7.71、8.43、10.69、11.59、14.53 min。GC-MS 条件多为毛细管柱分离，电子轰击离子源（electron impact ion source，EI）模式电离，质谱多采用反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）或SIM模式。以上试验表明添加浓度多数大于0.01 mg/kg，添加回收率在70.0%～110.0%，添加浓度在0.001～0.010 mg/kg的试验也符合添加浓度对回收率的要求[20]。对相关试验进行重复性检测表明，气相色谱串联质谱法具有良好重复性、仪器精密度良好（表2）。

表2 气相色谱-质谱联用仪在检测农产品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的应用

2.3 液相色谱质谱联用仪在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检测中的应用

液相色谱质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）杀菌剂残留检测以液相色谱串联质谱、高效液相色谱串联质谱和超高液相色谱串联质谱为主。在运用液相色谱质谱联用检测杀菌剂残留相关文献中，样品为果蔬或果酒，样品中有色素和糖类等共提取物，在试验中易产生干扰和基质效应，需配制基质标准曲线进行浓度校准。试验提取剂多采用乙腈，并对净化条件进行优化，采用氨基柱固相萃取或优化后的QuEChERS提取法较多。为提高试验准确度和精密度，还对前处理条件、色谱条件、质谱条件进行优化以及对标准溶液进行稳定性研究，如王云凤等[21]将果蔬样品进行乙腈提取、氯化钠盐析、固相萃取柱净化、GCB净化，采用大气压化学电离（atmospheric pressure chemical iosziaa-lion，APCI），SIM分析条件检测，选择离子为碎片离子、［M+H］+、［M+Na］+，试验灵敏度有所提高。徐潇颖等[22]对3种净化方法（凝胶固相萃取柱、氨基柱、QuEChERS）进行净化效果比较，结果表明，采用凝胶固相萃取柱净化时，吡唑嘧菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、嘧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯的回收率均低于其余两种方法；氨基柱净化时的结果精密度在1.0%～5.2%，QuEChERS方法净化时的结果精密度在2.1%～6.9%，选择氨基柱净化。果蔬样品也可以进行乙腈提取，氨基柱净化，电喷雾电离（electrospray ionization，ESI），正离子模式电离，MRM模式检测，如黄笑晨等[23]比较了乙腈∶水和甲醇∶水分别为流动相时对待测农药分离效果的影响，结果表明，乙腈∶水作为流动相时的灵敏度高于甲醇∶水且分离效果好，选择乙腈∶水为流动相。果酒样品以乙腈提取，C18、无水MgSO4净化，在ESI+模式下电离，MRM模式检测时，添加浓度水平为0.001～0.050 mg/kg，添加回收率在70.0%～110.0%，RSD均小于20.0%。周瑶等[24]优化质谱条件，调节锥孔电压、毛细管电压等参数后进行子离子扫描，优化碰撞能量，每个化合物选择2个子离子，以响应值高的子离子作为定量离子。果蔬样品以乙腈提取，固相萃取柱净化，ESI+模式电离，MRM模式检测吡唑醚菌酯、E－苯氧菌胺、啶氧菌酯、嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯在橙子、香蕉、苹果、菠萝中的回收率为60.4%～120.0%，RSD为2.15%～15.10%（表3）。

表3 液相色谱串联质谱在检测农产品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的应用

2.4 高效液相色谱法在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检测中的应用

在运用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的相关文献中，梁沛等[25]在前处理技术上进行创新，采用分散微固相萃取技术，以石墨烯作为分散微固相萃取吸附材料，进行萃取富集和净化；曾启华等[26]选择样品为果汁、香蕉、鸡肉组织（鸡肝、鸡肾和鸡肉），前处理采用三氯甲烷等，乙腈净化洗脱，利用色谱柱分离，对波长、流动相、流速的选择进行优化，结果表明，225 nm为最适检测波长、流动相为乙腈∶水、0.6 mL/min为最佳流速；王素茹等[27]将香蕉和土壤样品经乙腈提取、氯化钠盐析，固相萃取柱净化，正己烷淋洗NH2小柱，正己烷∶丙酮洗脱。以上试验表明，添加浓度均大于0.010 mg/kg，添加回收率在70.0%～110.0%，RSD均小于15.0%（表4）。

表4 高效液相色谱法在检测农（畜）产品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的应用

2.5 其他方法

采用其他方法检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留在国外文献中也有报道，如酶联免疫吸附分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 结合QuEChERS法建立一种检测残留量的方法；采用环境电离技术，解吸电喷雾（desorption electrospray ionization，DESI） 源耦合线性离子阱串联质谱（lon-trap tandem mass spectrometry，LT MS） 和直接分析实时（direct analysis of real-time，DART）离子源耦合飞行时间质谱（time of flight mass spectrometer，TOFMS）并与LC-MS/MS方法对比；采用近红外光谱法（near-infrared spectroscopy，NIRS）测定残留量。以上试验添加回收率为70.0%～110.0%，符合添加浓度对回收率的要求[28-30]（表5）。

表5 其他方法在检测农产品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的应用

3 生态环境（水环境、土壤环境）中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的检测方法

王璐芳等[31]将土壤样品经乙腈提取，PSA和C18净化，C18色谱柱分离，ESI+模式电离，MRM模式测定，UPLC-MS/MS检测丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺、醚菌酯、啶氧菌酯、氯啶菌酯、氟嘧菌酯、E-苯氧菌胺、烯肟菌胺、肟醚菌胺在不同植被类型土壤的残留量。试验结果表明，检测的这些杀菌剂的平均回收率为65.1%～103.9%，RSD为0.082%～14.000%。郭敏等[32]将土壤样品降解，批平衡法和HPLC法进行吸附试验，结果表明，HPLC法测定啶氧菌酯和肟菌酯在土壤、地下水中的回收率为74.4%～93.9%，RSD为3.80%～11.5%。付树卿[33]将农田水样品采用SPE方法进行富集和净化，二氯甲烷提取，GC-MS/MS检测农田灌溉水中啶氧菌酯残留量。试验结果显示，检测样品的回收率大于82.00%，RSD小于1.90%。吴润[34]经丙酮提取、甲醇定容，弗罗里硅土柱净化，C18柱分离，液相色谱建立土壤中的嘧菌酯的测定方法，结果表明，嘧菌酯在土壤中的回收率为88.82%～94.21%，RSD为2.56%～6.22%。李彩霞等[35]将土壤样品经乙腈提取，氯化钠盐析，正己烷定容，气相色谱GC-ECD检测，结果表明，醚菌酯在土壤中的回收率为88.00%～109.00%，RSD小于2.4%。

4 结论与展望

4.1 结论

笔者综述了农产品和生态环境（水环境、土壤环境）中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的检测方法。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的前处理多采用乙腈、乙酸乙酯作为提取剂；QuEChERS方法前处理方法以C18、PSA、GCB、无水 MgSO4为净化剂，相比常规净化处理更加快捷、高效且无害，该前处理方法的推广也会减轻检验工作量。在相关文献中，研究人员采用正交设计法进行优化试验，对前处理方法进行优化，以求试验的高精确度和准确度。仪器分析方面，国内文献多采用GC、GC-MS或LC-MS/MS检测；HPLC检测对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的回收率低于GC、GC-MS或LC-MS/MS，因此，较少采用。国外文献中提到的 ELISA、DART-TOF MS、DESI-LIT MS、NIRS等方法，虽然技术新颖先进，但技术不太成熟、灵敏度低且成本高，还有待改进，在国内的应用较少。

4.2 展望

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对环境有较好的相容性，国内外对农产品的残留检测试验较多，而在生态环境方面的研究相对较少，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对于环境的危害尚不明确。笔者认为不仅要关注甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在食品安全方面的危害，还要关注其在生态安全方面的危害。虽然该类杀菌剂对环境有较好的相容性，但前文也指出其对农产品和生态环境（水环境、土壤环境）存在一定的生态毒性。随着我国乃至全世界对农药残留越来越严格的管理，为了食品安全健康和生态环境良好，政府对检测机构的投入越来越多，对于ELISA、DART-TOF MS、DESI-LIT MS、NIRS等国内研究较少的技术，应加强研究，从而使其检测技术体系更加完备。笔者对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留检测的建议：一是加强对生态环境中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留检测，生态安全与食品安全同样重要；二是加大对新兴技术的研究力度，积极引入国外先进技术并且加强国内外交流；三是完善对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留限量的管理制度。