高等级生物安全实验室消毒灭菌关键技术与设备

黄 翠， 汤华山， 梁慧刚， 童 骁

（中国科学院a.武汉文献情报中心；b.武汉病毒研究所，武汉 430071）

0 引 言

生物安全实验室是科学家安全有效地开展传染性物质研究的场所，它不仅保护研究人员不受感染，还防止有害微生物进入环境。生物安全实验室按照防护级别的不同可分为：生物安全1 级实验室（BSL-1）、生物

安全2 级实验室（BSL-2）、生物安全3 级实验室（BSL-3）和生物安全4 级实验室（BSL-4）。高等级生物安全实验室包括BSL-3 和BSL-4。生物安全实验室的核心是“安全”，高等级生物安全实验室开展高致病性病原微生物研究，更是如此。通过采取有效的消毒灭菌技术针对实验室的目标物进行消毒和灭菌，是高等级生物安全实验室预防人员感染、防止病原微生物外泄、保障试验顺利开展的一项有效措施。本文系统阐述高等级生物安全实验室主要的消毒灭菌技术，以及关键消毒灭菌设备的特点和研发现状，包括压力蒸汽灭菌器、污水处理设备和气（汽）体消毒设备。

1 高等级生物安全实验室消毒灭菌关键技术

高等级生物安全实验室的实验物品或材料通过消毒灭菌后得到安全处理，对于防止病原微生物的积累和传播发挥着关键作用。消毒一般是指使用一种液体化学品消除工作台面和设备上除细菌孢子以外的几乎所有病原微生物。灭菌是指使用物理或化学方法消灭所有微生物，包括高抗性的细菌内生孢子［1］。由此可以看出，相比消毒，灭菌杀灭微生物更彻底。高等级生物安全实验室采用的消毒灭菌方法按照原理不同可分为化学法和物理法［2］。

1.1 化学法

化学消毒灭菌方法通常是指对无生命的物体使用化学杀菌剂或消毒剂。消毒灭菌效果受生物的种类和数量、有机物的数量、被消毒的对象以及化学品接触时间、温度和浓度等因素的影响。通过比较化学消毒剂作用在无生命物质表面的活性水平不同，作为选择化学消毒方法与消毒剂分类的依据。

2020 年，美国疾病预防控制中心和国立卫生研究院联合发布的《微生物和生物医学实验室生物安全（第六版）》［3］（BMBL6）中，按照杀灭微生物能力的不同，将化学消毒水平分为灭菌（sterilization）、高水平消毒（high level disinfection）、中水平消毒（middle level disinfection）和低水平消毒（low level disinfection）（见表1）。

表1 化学消毒水平

（1）液体消毒剂。BMBL6 还描述了实验室常用液体化学消毒剂的消毒水平（见表2）。液体消毒剂的效果随生物体、浓度、接触时间和其他使用条件的不同而不同。没有一种液体消毒剂在所有条件下对所有活病原体都有同样的作用或效果。在生物安全实验室中，液体消毒剂可用于表面去污，当使用足够浓度时，可作为液体废物最终排入卫生下水道之前的消毒剂。在实验室的实际操作中，选择的液体消毒剂都需要经过验证对实验研究的生物体有效。

表2 实验室液体化学消毒剂的活性水平

在高等级生物安全实验室中，可利用液体消毒剂对不透水的固体物体（如：不锈钢桌面）进行表面消毒（通过制造商提供的产品使用方法和高等级生物安全实验室内部实验验证），消毒后的混合液通过水槽或地漏输送到液体污水净化系统进行冗余处理。这种化学消毒方法的一个例子是化学消毒剂淋浴系统，在该系统中，穿着正压服的研究人员在离开BSL-4 空间之前，通过化学淋浴顺序有效地对他们的正压服外面进行消毒［4］。此外，消毒剂还可用于对高等级生物安全实验室产生的废液进行消毒（该过程可以在排放到液体污水处理系统之前在容器中进行），消毒过程是将液体消毒剂与潜在污染的液体废物溶液进行物理混合，溶液的具体比例、混合程度和接触时间需要通过生物指标的验证预先确定。

（2）蒸汽和气体消毒剂。蒸汽和气体消毒剂在封闭系统中和受控的温度和湿度条件下使用时，可提供极佳的消毒灭菌效果。由表2 可以看出，在一定的条件下，使用戊二醛、甲醛、过氧化氢、二氧化氯、过氧乙酸等消毒剂可以达到灭菌的目的。高等级生物安全实验室通常利用气溶胶、蒸汽或气相的戊二醛、多聚甲醛（paraformaldehyde）、过氧化氢、二氧化氯、过氧乙酸等对密封的实验室房间、设备等进行气（汽）体处理，以确保对空间内的所有区域进行彻底净化，包括设备后面或组件面板内难以进入的空间。该方法主要用于净化生物安全柜、动物房及其相关系统、不适用液体消毒剂的大型或固定设备、可能被其他消毒方法损坏的仪器或光学设备、房间、建筑物及相关的空气处理系统等。目前越来越多的高等级生物安全实验室利用汽化过氧化氢进行消毒灭菌。

1.2 物理法

高等级生物安全实验室设备、废弃物等的消毒灭菌还可通过物理加热、辐射等来完成。

（1）加热。实验室的加热灭菌技术可分为湿热灭菌和干热灭菌，其中湿热灭菌是最可靠的灭菌方法，压力蒸汽灭菌是最常用的一种湿热灭菌方法。压力蒸汽灭菌，有时也称为蒸汽灭菌，是使用加压蒸汽杀死传染性病原和使蛋白质变性的方法，是迅速消灭所有形式的微生物最便捷的方法。压力蒸汽灭菌器使用饱和蒸汽，在0.103 4 MPa的压力下，腔室温度在规定的时间（通常为30 ～60 min）内达到至少121°C。除了适当的温度和时间外，防止空气滞留对于实现无菌性也至关重要。要灭菌的材料必须与蒸汽和热充分接触。压力蒸汽灭菌是一种对高等级生物安全实验室设备和生物危险废物进行灭菌的可靠方法。但需要注意的是，压力蒸汽灭菌器不能去除化学污染。

干热灭菌比湿热灭菌效率低，需要更长的时间和/或更高的温度才能达到灭菌效果。干热灭菌适用于在不透水的非有机表面（如玻璃）上破坏活生物体，但在有可能充当隔热层的浅层有机或无机材料存在的情况下，干热不可靠。玻璃器皿的干热灭菌通常可在160

～170°C的温度下进行2 ～4 h。焚烧是一种非常有效的干热灭菌方法，可用于废弃污染物的最终灭菌和处置，还可用于微生物培养过程中接种针、接种环等的“点”灭菌。

（2）辐射。辐照主要用于灭活病原体，以便在较低的防护水平下进行研究，也可用于对小型固体、半固体或液体物质进行消毒灭菌。对于那些对热和/或化学处理敏感的材料来说，这是首选的消毒灭菌方法。实验室需要采取这种方法进行消毒灭菌的物品包括溶剂、塑料仪器或生物材料（如有机成分会因另一种消毒手段而遭到破坏的组织培养物）。辐射可分为电离辐射和非电离辐射。①电离辐射。电离辐射虽然可破坏微生物，但由于其对生物体的危害性，不是实验室常用的灭菌工具。在某些特殊的情况下，电离辐射在少数高等级生物安全实验室中有应用。辐照过程首先是将材料置于屏蔽室中，然后将其置于一定时间、一定剂量的伽马辐照之下。伽马射线由钴-60 等放射性同位素产生，穿透材料的质量，通过电子的运动将少量的高强度能量传递给材料的分子。这个过程会破坏任何微生物的生存能力。伽马射线照射是否成功地灭活微生物是通过生成“杀伤曲线”或“剂量反应曲线”来确定。也就是说，将病原微生物暴露在规定剂量的伽马射线照射下，然后培养病原微生物以确定其生存能力［5］。②非电离辐射。紫外线（UV）辐射的UV-C 波段包含的波长（250 ～270 nm，265 是最佳波长）可以有效地消灭空气和水以及表面的大多数微生物。生物体必须直接暴露在紫外光下，污垢、灰尘和阴影会屏蔽生物体，从而限制紫外灯的效果。紫外线辐射通常用于降低空气中微生物的水平，并保持气闸、动物饲养区、通风柜和实验室房间等的良好空气卫生。紫外线还用于生物安全柜（BSC）和一些实验室房间的消毒灭菌，以减少表面污染。由于其穿透力差，对空气流动敏感，需要较长的接触时间而受到极大限制，不是有效的灭菌方法。

2 高等级生物安全实验室消毒灭菌关键设备

2.1 压力蒸汽灭菌器

国际和国内生物安全实验室相关标准都明确规定，BSL-3 和BSL-4 必须配备蒸汽灭菌器。目前大多数标准蒸汽灭菌器都适用于BSL-1 和BSL-2 实验室。但是，高等级生物安全实验室要求蒸汽灭菌器具有标准蒸汽灭菌器设计所不具备的其他功能［6-9］。

（1）双门设计。大多数高等级生物安全实验室的蒸汽灭菌器有两个门，门为联锁装置，不允许两个门同时打开。物品“通过”蒸汽灭菌器从受污染房间运送到洁净房间。未经有效灭菌的实验室废弃物无法从灭菌器双门通道带出实验室。生物安全型蒸汽灭菌器都有安全控制设计，这种机械安全功能有助于防止微生物从受污染的一侧传递到未受污染的一侧。换句话说，当一扇门打开时，另一扇门不能打开。门联锁系统是机电式的，即使在发生断电或断水的情况下，它也是安全的。防止两扇门同时打开还有助于防止大量空气通过灭菌器腔室，从而保持一致的空气差。控制系统只有在电气确认两扇门都关闭后才会启动循环。此外，非封闭一侧的门是锁定的，防止在灭菌循环中止或没完成的情况下门被打开。

（2）生物密封。蒸汽灭菌器安装在分隔两个房间的墙壁开口中，设备主体与实验室墙壁连接处需要做到密封。灭菌器自身的穿墙管线也需要专门设计有耐高温和密封特性。适用于高等级生物安全实验室的生物安全型蒸汽灭菌器配有生物密封法兰或生物密封件。生物密封圈由钢或不锈钢板组成，连续焊接在灭菌器的四面。隔离墙法兰的所有穿透口（无论是电线还是管道）都是完全密封的，以防止空气泄漏。生物密封件可在危险侧（封闭实验室一侧）和安全侧（非封闭实验室一侧）之间提供隔离和可靠的密封，这对于保障人员安全至关重要。

（3）门垫圈密封。门垫圈通常由固态硅橡胶制成，厚度至少为6.35 mm。为保障安全，蒸汽灭菌器不依赖空气或蒸汽的压力来实现密封，而是依靠门关闭时对门密封垫圈的压力。这被称为“被动”垫圈设计。优点包括：如果被刺破，不会放气；不需要空气或蒸汽进行充气；如果失去压缩空气或蒸汽，不会放气；纯机械密封，因此是安全的；在需要更换垫片时，无需工具或粘合剂即可更换，从而减少了维护时间。

（4）废气、废水安全排放系统。美国塔夫茨大学的一项研究表明，各类蒸汽灭菌器在循环的预处理阶段会通过腔室排水管排出细菌［10］。细菌可能成为气溶胶，并排入地漏和周围环境。因此，在将灭菌器废气、废水排入环境之前，需要对其进行封闭、过滤或净化。一般有3 种方法可对蒸汽灭菌器中的废气、废水进行净化处理，分别为：在蒸汽灭菌器的腔室内设置超高效HEPA过滤器；在蒸汽灭菌器的腔室外部安装超高效HEPA过滤器；设置外部净化室，污水被排放到一个外部净化池中，在净化池中加入蒸汽以消灭细菌。

国外生物安全型蒸汽灭菌器自上世纪90 年代开始生产，主要生产厂家有瑞典Getinge 公司和德国Systec公司。目前瑞典Getinge 公司的GEB 系列生物安全型蒸汽灭菌器产品在大型生物安全型蒸汽灭菌器（300L以上）市场中占据绝对优势，德国Systec公司的D系列生物安全型蒸汽灭菌器产品在小型生物安全型蒸汽灭菌器（200L以上）市场中占据绝对优势［11］。目前国内尚无完全符合高等级生物安全实验室要求的生物安全型蒸汽灭菌器，仅山东新华医疗器械股份有限公司和江苏连云港千樱医疗设备有限公司开始了可在BSL-3 使用的生物安全型蒸汽灭菌器的相关研究。行业其他公司多为中小型规模企业，生产的产品趋于中低端，并且产品类型简单、同质化严重，缺少对新型高端产品的研发和创新等。

2.2 污水处理设备

污水处理系统（Effluent Decontamination Systems，EDS）是处理所有实验室废水和生物防护设施内产生的污水所必需关键设备。实验室污水通常来自实验室内部房间的水槽、淋浴、地漏和高压灭菌器。全球BSL-3 和BSL-4 实验室都有要求对实验室污水进行灭活处理。

EDS包括化学处理系统和热处理系统，目前高等级生物安全实验室较为常用的是污水热处理系统。污水热处理系统使用热和压力的组合，确保高等级生物安全实验室产生的污水在排放到公共下水道之前，其中任何潜在的危险微生物病原体被破坏。例如，某BSL-4 实验室房间配备了不锈钢水槽和浮水槽，用于接收在日常实验室活动中产生的化学净化液体，水槽和地漏都连接到污水处理系统。在BSL-4 水槽和地漏的下游有3 个5.685 t的液体污水处理罐，通过加压的蒸汽-热传导夹套，将污水处理罐内腔中的温度提升到有效杀菌温度，进入预定灭菌循环，循环结束后，液体被冷却并排放到pH中和系统。

目前，根据运行方式的不同，高等级生物安全实验室使用的污水热处理设备可分为序批式污水热处理设备和连续流式污水热处理设备。二者根本区别在于序批式活毒废水处理工艺将废水储存后再处理，连续式活毒废水处理工艺则采取边收集边处理的方式。

（1）序批式污水热处理设备。该系统采用蒸汽夹套式批处理系统，利用蒸汽夹套将处理腔室周围的液体流出物加热到灭菌温度一段时间。然后，液体废物在被排入卫生下水道系统之前被冷却。包括序批式蒸汽系统和序批式蒸汽喷射系统。序批式蒸汽喷射系统是在序批式蒸汽系统的基础上，在处理罐中增加了蒸汽喷射，通过组合加热夹套和直接向污水负荷中注入蒸汽，加热时间可以缩短一半。此外，直接蒸汽喷射还能搅拌污水，使热量分布更均匀［12］。

（2）连续流式污水热处理设备。连续流式污水热处理系统包括一个缓冲储存室，然后是一个密封泵，该密封泵将污水通过加热热交换器，然后通过一系列绝缘线圈，再通过冷却热交换器，最后排入下水道系统。密封泵在系统中保持恒定的流量，在设计系统前必须确定流量。通过流经一系列绝缘线圈，可将污水温度在设定的时间内维持在灭菌温度。线圈长度是根据污水流速设计的。加热源可以是蒸汽、电或天然气［13］。

目前，全球领先的污水热处理设备制造商包括法国ACTINI公司，该公司的代表性产品为“ACTINI”连续流式污水热处理设备；此外还有美国Bio-Response

Solutions公司，产品包括Bio-Response 序批式污水热处理设备和连续流式污水热处理设备。这些公司生产的污水热处理设备已广泛应用于全球高等级生物安全实验室。我国山东新华医疗已成功研制出序批式污水热处理设备，还未在国内高等级生物安全实验室广泛应用，需要进一步进行安全性和可靠性评价。目前尚无国产连续流式污水热处理设备，还处于研发过程中［14］。

2.3 气（汽）体消毒设备

使用液体消毒剂进行表面去污往往是最简单的方法，是日常清洁的理想选择。然而，当大面积和复杂的设备需要去污时，气体方法或熏蒸剂往往是更好选择。在这些情况下，液体消毒剂擦拭技术可能很耗时，难以标准化，可能根本不可行。在这些情况下，气（汽）体净化方法具有优势，因为它们能够覆盖大面积的表面和更难到达的区域［15］。国内外相关标准/法律（如EC指令2009/41/EC）要求BSL-3 和BSL-4 在出现意外泄漏或日常维护后，必须使用可靠和有效的方法进行全室消毒处理。

目前，世界上用于生物安全实验室消毒的气（汽）体消毒剂主要有甲醛、气体二氧化氯（GCD）和汽化过氧化氢（VHP）。与甲醛和GCD 相比，VHP 使用更安全，不致癌，且对环境友好，因此近年来越来越多的高等级生物安全实验室采用VHP 对实验室空间和大型设备进行消毒灭菌。

目前市面上的过氧化氢蒸汽发生器多数是由英国Bioquell和美国Steris 公司生产［16］，此外还有德国PEA Geschko 汽化过氧化氢发生器。这里以美国Steris公司的一款过氧化氢蒸汽发生器Steris VHP 1000-ARD系统［17］为例说明，该系统使用的是35%过氧化氢溶液（Vaprox®），去污过程包括4 个阶段：①除湿。通过集成的干燥剂系统去除房间内的湿度。②调节。Vaprox®被汽化，并由发生器注入房间，以迅速提高VHP的水平至有效浓度。③去污。通过不断向房间内注入VHP 来维持VHP 浓度，以有效杀灭微生物。④通风。停止注入VHP，利用送风和排风清除室内的VHP。

浙江泰林生物科技有限公司和上海东富龙科技有限公司开发了用于生物安全实验室的移动式VHP 消毒设备，分别代表了“干法”和“湿法”VHP 消毒设备的两个方向。目前国内高等级生物安全实验室仍以进口VHP 消毒器设备为主，国产VHP 消毒设备有小范围应用，国内相关企业在技术成熟度和产品研发升级等方面正在不断提升。

3 结 语

安全有效的消毒灭菌对于保障高等级生物安全实验室的“安全”至关重要。近年来，我国已建成了一批高等级生物安全实验室，截至2018 年9 月，我国通过中国合格评定国家认可委员会认证认可的BSL-3 有78 个，建成的BSL-4 有3 个［18］。2016 年，国家发展改革委和科技部共同发布《高级别生物安全实验室体系建设规划（2016 ～2025 年）》，计划加快建成我国高等级生物安全实验室体系。但由于我国高等级生物安全实验室特别是BSL-4 建设起步较晚，符合相关要求和标准的国产消毒灭菌技术与设备研发还没有跟上，无法满足国内高等级生物安全实验室发展和建设的需求，因此相关技术和设备主要依赖进口，除了价格昂贵之外，还存在设备维修和维护不便等问题。我国亟须在高等级生物安全实验室消毒灭菌技术方面加强探索、突破瓶颈、推动创新，提升我国在相关领域的技术成熟度和创新能力，加强国产消毒灭菌设备的实践检验和认证认可，彻底改变我国高等级生物安全实验室消毒灭菌技术和设备长期以来受制于人的局面。