应用酶标仪的糖含量测定实验教学改革

董 楠， 曹颖男

（广州新华学院a.医学公共课教学研究部，b.药学院，广州 510520）

0 引 言

生物化学实验作为重要的实践教学环节，在巩固和加深理论知识、锻炼学生掌握实验操作技能、提高学生分析和解决问题能力、培养严谨治学的态度以及创新能力等综合素质的培养上，有着不可替代的作用［1-3］。传统的生化实验教学检测手段单一，学生能掌握到的检测方法有限，在生化检测技术方面的知识得不到拓展，学生做实验缺乏积极性和主动性，达不到理想的教学效果，所以将部分研究型仪器拓展到实验教学应用中，已成为近年来改进实验教学方法的重要手段之一［4-6］。酶标仪作为生物检测技术常规仪器被广泛应用于临床检验、生命科学研究、农业科学、食品和环境科学等领域［7-10］，所以掌握该技术对应用型人才的培养至关重要，但目前酶标仪大多应用于科研领域，在本科教学中少有涉及，本研究在生物化学实验教学过程中引进酶标仪检测技术，该技术具有操作简便快速、节约耗材成本、减少对环境和仪器污染等优点，在教学过程中能够提高实验效率，激发学生实验兴趣，培养学生科研创新能力，为学生今后走向工作岗位打下良好的基础。

1 实验教学改革设计依据

由于酶标仪的工作原理与紫外分光光度计的原理类似［11］，基于此可将原来用紫外分光光度计测试的实验改进后应用酶标仪进行测试。本科生物化学实验涉及用紫外分光光度计测试多为定量测定实验，根据实验项目可操作性，将实验“3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测还原糖含量”改进后，应用酶标仪代替分光光度计，对番茄汁中总糖含量进行测试，并与紫外分光光度计测试方法进行对比，体现酶标仪检测方法在实验教学过程中的优越性。

2 实验部分

2.1 实验仪器和试剂

SpectraMax iD3 型酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；HH-ZK8 型恒温水浴锅（郑州英峪予华仪器有限公司）；移液器（上海宝予德科学仪器有限公司）。

番茄汁（新鲜）；实验用水均为arium mini plus 超纯水机制备。

HCl溶液（6 mol/L）；NaOH 溶液（6 mol/L）；酚酞指示剂；3，5-二硝基水杨酸溶液（DNS）；葡萄糖标准溶液（1 mg/mL）；葡萄糖标准储液（0.2 mg/mL）；总糖样品（浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL）。

2.2 实验操作方法

（1）番茄总糖溶液制备。番茄榨汁后放入离心管中，3 000 r/min 离心10 min，取出。取番茄上清液1 mL加入大试管中，再加入6 mol/L 盐酸5 mL，沸水浴30 min，取出，冷却后转移至100 mL 烧杯中，加入20 mL蒸馏水。滴入1 滴酚酞，用6 mol/L NaOH中和溶液后定容至100 mL 容量瓶中，即待测番茄总糖溶液。

（2）葡萄糖标准曲线绘制。取葡萄糖标准液0，20，40，…，200 μL到1 ～11 号小试管，每个试管中加蒸馏水至总体积200 μL，再加入200 μL DNS混匀，沸水浴4 min，取出冷却，每管中加入1.600 mL蒸馏水混匀。各取200 μL 样品依次加入酶标板中（3 个平行样），用酶标仪在波长540 nm 下测试各样品吸光度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值（A540）为纵坐标，得到葡萄糖标准曲线。

（3）番茄总糖含量测定。取200 μL 待测总糖溶液到小试管中，加入200 μL DNS，沸水浴4 min，取出冷却，每管加入1.600 mL蒸馏水混匀，取200 μL样品加入酶标板中，540 nm 波长下用酶标仪进行测试，计算番茄总糖含量：

式中：C为总糖含量（g/L）；M为测得的糖含量（μg）；V为加样体积（μL）；N为样品稀释倍数。

（4）加标回收率试验。量取5 种不同浓度总糖样品各200 μL，加入到5 支小试管中，分别加入葡糖糖标准储液200 μL，再加入200 μL DNS，沸水浴4 min，取出冷却，加入1.400 mL 蒸馏水混匀。各取200 μL样品加到酶标板中，540 nm 波长下用酶标仪进行测试，计算加标回收率。

2.3 实验教学实施方法

教师讲解完实验内容后，带领学生进入仪器室讲解演示酶标仪的操作方法、测试注意事项以及数据的处理方法，之后学生回到课室进行上述实验操作内容，2 人/组，15 组/班，完成实验操作过程后，每组学生将加好样品的酶标板放入酶标仪中依次进行测试。

为规范学生操作，统一规定酶标板中加样模式如图1 所示，每个样品均设置3 个平行样呈垂直分布，绿色孔为空白样（1 号标准样作为空白样）；粉色孔区依次为标准样1 ～11 号；红色孔区依次为未知样1 ～6

号，标紫色底线的1 号未知样，即总糖含量待测样，标绿色底线的2 ～6 号未知样，即加标回收率试验待测样。学生需将所有样品均加入酶标板后一次完成测试。

图1 酶标板中加样模式

2.4 结果与讨论

葡萄糖含量的标准曲线和线性方程如图2 所示，R2值为0.997 1，标准曲线的线性良好，酶标仪测得标准样结果数据如表1 所示，1 ～11 号为标准曲线实验的标准样测试结果，以1 号标准样作为空白样，测试时样品与空白样的吸光度值自动相减，差值即为样品的吸光度测试结果值，因为酶标仪精确度较高，测得的1号标准样可能会有微小数值（可能为负值），同时因3个平行样数值很小，即便微小差值也会导致CV 异常变大（如1 号标准样CV）。检测结果显示SD 值在0.001 ～0.014 之间，CV 值基本小于5%，具有较好的精确度和准确性，说明酶标仪检测方法适用于糖含量测定实验。

图2 葡萄糖标准曲线及线性方程

表1 标准样品测试数据结果

1 ～6 号未知样测试结果数据如表2 所示，1 号未知样为番茄汁总糖含量测试结果，3 组平行样均值为47.48 μg，代入式（1）中可计算出番茄汁中总糖含量为23.74 mg/mL。

表2 未知样品测试数据

为培养学生科研创新能力，增设加标回收率试验，结果见表2 中2 ～6 号样品数据，未知样的SD值较小，CV值均小于5%，说明测试结果具有良好的准确性和精密度，回收率计算结果见表3，5 种总糖样品回收率在97% ～110%之间，平均值为104.31%，且RSD ＜5%，说明采用酶标仪检测方法测试番茄汁中总糖含量方法准确可靠。

表3 加标回收率试验结果

DNS比色法是常用的多糖含量测试方法，一般采用紫外分光光度计为测定仪器，但由于其样品池位数有限，样品较多或多波长测定时，操作时间较长，步骤繁琐，极大地影响了学生实验效率［12］，同时因测试时间长，对于不稳定的样品可能会造成实验结果误差。本实验采用酶标仪代替分光光度计进行总糖含量测试，在文献［13-14］研究的基础上，选取合适的测量波长和葡萄糖标准液浓度，同时通过前期实验探索出总糖溶液制备最佳条件、回收率试验5 种总糖样品的适宜浓度以及可行的实验操作实施方案，最后通过实践测得实验数据结果良好，大大提高学生实验效率，与紫外分光光度计方法对比，酶标仪检测技术在测试时间、操作过程、实验结果以及创新性等方面体现出优良的特性，具体如表4 所示。

本实验采用的SpectraMax iD3 型多功能酶标仪具有光吸收、发光和荧光3 种功能，根据不同功能可以进行生物化学实验中的DNA、RNA及蛋白定量和纯度检测、ELISAS/酶学动力学检测、细胞活力和细胞增殖检测、绿荧光蛋白检测、激酶和ATP酶分析等实验，为我校医学相关专业的学生进行科研实验学习研究提供了有力保障。

表4 酶标仪检测方法与紫外分光光度法的对比

学生实验课全程表现出较高的学习热情，实验操作过程认真积极，并会针对感兴趣的知识点及操作要点等提出问题，教学互动氛围良好，普遍受到学生欢迎。后续可根据学生实验教学内容需要，以学生兴趣班、选修课以及大学生创新创业训练计划项目等形式，开展相关生化实验项目研究，拓展学生课外实验操作技能，提高学生自主科研创新能力。

3 结 语

将科研仪器应用到本科生物化学实验教学当中已成为现在高等教育改革中非常重要的环节之一［4］，随着酶标仪的广泛使用，其被证实可替代分光光度计，测试的结果数据线性关系良好，具有较好的准确度、精密度和稳定性。采用酶标仪检测技术进行本科生物化学实验教学能够提高学生实验效率，培养学生科研实验技能，拓宽学生专业知识面，同时也能激发学生的学习热情，提高综合素质，更能适应当今社会对人才培养的需求。