一种新型无毒的氨氮含量检测方法及其干扰因素探究

孔令明， 陈知雨， 徐瑜聪， 贾昌锋

（山东大学海洋学院，山东 威海 264209）

0 引 言

水体中的氨氮由非离子化的氨（NH3）和铵（NH4+）组成，这两种存在形式处于与pH 和温度相关的平衡状态。当水的pH 值低于8.75 时，NH4+是最主要的存在形式，NH4+相对无毒，而当pH 值高于9.75时则NH3为主，NH3的毒性较高。NH3的比例随着pH 值和温度的升高而增加［1］。氨氮作为我国水污染的主要污染因子之一，是我国水体环境监测的重要指标，目前有4 种测定氨氮（ammonia nitrogen，NH3-N）的国家标准［2］。

本科生的教学和科研中，常要监测养殖环境水体，发酵液中的氨氮含量。常用的测定方法包括纳氏比色法、吲哚酚蓝（IPB）比色法、水杨酸比色法和蒸馏-中和滴定法等［3-4］。纳氏比色法所必需的纳氏试剂是一种由碘化汞（HgI2）或者二氯化汞（HgCl2）和碘化钾（KI）在强碱性溶液中组成的溶液，它与NH3反应生成淡红棕色络合物，该络合物在420 nm 有吸收峰，吸光度在一定范围内与NH3的含量成正比［5］。IPB 比色法基于Bethelot 反应，其中NH3在碱性条件下与苯酚和次氯酸反应，反应产物再与另一分子苯酚反应生成与样品中NH3浓度成正比的蓝色吲哚酚［6］。水杨酸盐法实际上是IPB法的改进，其中水杨酸钠代替苯酚。这种改进消除了有毒且易挥发的邻氯苯酚的产生。在水杨酸法中，NH3与次氯酸反应生成的一氯胺，再与水杨酸反应生成蓝绿色的5-氨基水杨酸盐［7］。以上方法虽然得到了广泛应用，但缺点也显而易见，那就是所用试剂往往含有危险物质，容易造成人员伤害和环境污染。其中，纳氏分光光度法需使用HgI2或HgCl2等剧毒物质，并且试剂的寿命相对较短，反应易受pH值和时间的影响；IPB法用到的苯酚有毒、且具腐蚀性气味；水杨酸分光光度法需使用浓硫酸，且使用前需对有次氯酸钠溶液的有效氯浓度和游离碱浓度进行标定，流程繁琐［8］。蒸馏-中和滴定法同样需使用浓硫酸试剂，且实验为滴定实验，操作复杂、人为误差较大。在高校本科实验中，实验安全是最重要的也是最受人们关注的问题［9-10］，而这些实验方法均会对实验室安全及实验人员的安全造成潜在威胁。

Ma等［11］在传统IPB 的基础上，做了几个方面的优化，如用邻苯基苯酚（OPP）代替有毒和有气味的苯酚。OPP是一种无毒、无腐蚀性且稳定存在的片状晶体；用二氯异氰尿酸钠替换了不稳定的次氯酸钠试剂。该研究还在不同的试剂浓度、温度和盐度下优化了OPP反应的动力学。该系统具有反应相对快，毒性低和试剂制备方便的优点。本研究选择了不同年级的大学生评估了该方法的可重复性，并探索了该方法的干扰因素，为该方法的进一步应用提供改进。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂与耗材

试剂：柠檬酸三钠（C6H5Na3O7，CAS 号：68-04-2）；邻苯基苯酚（OPP，CAS 号：90-43-7）；二氯异氰尿酸钠（NaDTT，CAS 号：2893-78-9）；硝普钠（NP，CAS号：13755-38-9）；氯化铵（NH4Cl，CAS 号：12125-02-9）；氢氧化钠（NaOH，CAS 号：1310-73-2）；三氯化铁（FeCl3，CAS号：7705-08-0）；超纯水（18.2 MΩ·cm）。

耗材：50 mL 离心管；0.45 μm 过滤器；100 mL 容量瓶、100 mL 量筒。本方法所使用到的器皿，均应经碱性水（超纯水用NaOH调到pH 9.5）清洗，以去除残余的氨氮。

1.1.2 实验仪器

电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司，DGG-9140B型）；紫外可见分光光度计（上海美析仪器有限公司，UV-1800）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司，JY92-IIN）；恒温培养摇床（哈东联，HZQ-F160）；10 mm石英比色皿。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制

（1）饱和柠檬酸三钠溶液。将42.5 g 柠檬酸三钠溶解在100 mL水中，加热溶解，制得饱和柠檬酸三钠溶液（4 ℃保存可稳定数月）。

（2）20 g/L 碱性OPP 溶液。将2 g OPP 和1 g NaOH溶解在水中，定容至100 mL，制得20 g/L 碱性OPP溶液（4 ℃保存可稳定至少10 天）。

（3）10 g/L碱性NaDTT溶液。将1 g NaDTT和1 gNaOH溶解在水中，定容至100 mL，制得10 g/L碱性NaDTT溶液（4 ℃保存可稳定至少10 天）。

（4）5 g/L 碱性NP 溶液。将0.5 g NP 和6 g NaOH溶解在水中，定容至100 mL，制得5 g/L 碱性NP溶液（4 ℃保存可稳定至少10 天）。（5）NH4Cl溶液的制备。制备前需用烘箱105 ℃干燥2 h。将干燥的NH4Cl 溶于超纯水制备20 mg/L的NH4Cl溶液。

1.2.2 实验原理

在碱性环境下，NH3与次氯酸盐在NaDTT催化下反应生成一氯胺；一氯胺与OPP反应生成2-苯代对本醌氯亚胺；2-苯代对本醌氯亚胺再与OPP 反应形成靛蓝的吲哚酚（IPB），颜色的深浅与NH3的浓度具有显著的相关性，并在700 nm处有最高吸收峰。反应式及化学符号如下［11］：

1.2.3 标准曲线绘制

选择大学二年级、三年级、四年级本科生各10 名，分别进行标准曲线绘制。

（1）实验开始前需用少量碱性水（pH 9.5）润洗所有实验仪器，除去残余的氨氮的干扰，并用超纯水洗净晾干，用于试剂制备（除定容外，其他操作均在聚丙烯管中进行）。

（2）分别取20 mg/L的NH4Cl溶液按表1 所示要求进行稀释操作，制备标准液，用于标准曲线测定。

（3）取25 mL标准液或样品于50 mL 离心管，加入4 mL饱和柠檬酸三钠溶液，充分混匀。

（4）加入1 mL OPP溶液，充分混匀。

（5）加入1 mL NaDTT溶液，充分混匀。

（6）加入1 mL NP 溶液，充分混匀，静置20 min（形成的IPB最长能稳定24 h），使用10 mm石英比色皿，检测其在700 nm处吸光度。

表1 用于绘制标准曲线的浓度梯度

1.3 准确度与精密度

1.3.1 准确度

检验方法的准确度可采用加标回收评估法。国标中对加标回收率的定义为：仪器通过分别测定加入标准溶液前后的实际水样得到的增量相对于加入已知量的百分率。分别吸取试剂1、4、7、8 号标准液，测定其显色后的吸光度，并根据结果选择相应标准曲线得出添加量，计算加标回收率。

1.3.2 精密度

精密度采用相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）进行评价。按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ168—2020）的要求计算RSD［12］。

1.4 影响因素探究

1.4.1 氨基酸的影响

分别取0.1 g脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、丙氨酸，配置成1 g/L 的母液100 mL。分别稀释成为50、100、200、400 mg/L，用NH4Cl 标准液调整各梯度组中NH3-N 的含量为0.64 mg/L，然后依次加入柠檬酸三钠饱和溶液、OPP、NaDTT、NP 混匀配置成待检测液，静置后测定其在700 nm处吸光值。

1.4.2 三价铁离子的影响

配制200 mg/L 的FeCl3溶液与200 mg/L 的NH4Cl溶液，然后配制成含50、100 mg/L FeCl3的0.64 mg/L NH4Cl的工作液，后依次加入柠檬酸三钠饱和溶液、OPP、NaDTT、NP 混匀配置成待检测液，静置后测定其在700 nm处吸光值。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线测定

2.1.1 绘制标准曲线

通过30 次不同年级操作人员的重复测定，标准曲线R2值均在0.99 以上（见图2），表明该实验方法操作简便，可重复性较高。

2.1.2 精密度与准确度

根据绘制的标准曲线y= 1.119 8x+ 0.053（R2= 0.999 8）（后续氨氮计算均使用此方程）与测定吸光度计算所测标准液浓度，分别计算RSD值与加标回收率，结果见表2、3。

图2 氨氮测定标准曲线

表2 RSD值计算

表3 加标回收率计算

研究结果显示，不同浓度下RSD 匀小于3%，加标回收率为100.9% ～109.5%，因此该方法有较高的准确度和精密度，能够满足水样中NH3-N的分析测定要求。

2.2 氨氮测定影响因素探究

2.2.1 氨基酸对氨氮测定的影响

本研究分别选取了甲硫氨酸、丙氨酸、色氨酸、甘氨酸4 种一级氨基酸，以及脯氨酸这种二级氨基酸来探究其在不同浓度下对氨氮测定的影响（见表4），结果发现，氨基酸对氨氮测定产生了严重影响，并且在同样质量体积下小分子的丙氨酸和甘氨酸影响最大。因此在测定氨基酸含量高的废水、发酵液时要予以特别注意。

表4 不同浓度氨基酸对氨氮测定的影响 mg/L

2.2.2 Fe3+对氨氮测定的影响

柠檬酸三钠能有效地螯合二价金属离子如钙离子、镁离子等，以消除这些离子对结果的影响，但在碱性条件下其螯合三价铁离子的能力较差［13］。Fe3+在小于8.631 mg/L 时基本不会影响氨氮的测定，但当Fe3+浓度达到17.262 mg/L 时，对测定结果产生较大影响，使测定值达到实际值的2 倍（见表5）。现有方法对样品的前处理多从去除钙、镁离子出发［14］，而并未有效除去三价金属离子，如Fe3+，从而可能导致测定结果偏高。

表5 不同浓度Fe3+对氨氮测定的影响

3 结 论

氨氮的测定在水产养殖、环境监测、发酵液水质监测中具有至关重要的作用［15］。新型无毒的氨氮含量检测方法具有以下几个方面的优点：①所用试剂相对稳定，不受盐度干扰；②与国标法中需要的HgCl2、HgI2和浓H2SO4等剧毒、强腐蚀性试剂相比，该方法所用试剂安全无毒，实验操作更加简便，且试剂与显色产物更加稳定，利于长时间保存，降低了实验操作带来的误差；③经多位同学试验，均成功做出R2大于0.99的标准曲线，且各组数据RSD值均小于3%，加标回收率在100.9% ～109.5%之间，具有较高的准确度、精密度和可重复性；④测定波长为700 nm，所用仪器简单。因此，该法非常适用于本科教学实验中水体氨氮浓度的测定。