牛传染性鼻气管炎病毒gI 蛋白截短表达与单克隆抗体制备

侯丽娜，于明华，刘春羽，赵洪哲，郑秉武，温永俊，王凤雪

（1.内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2.呼和浩特市动物园，内蒙古呼和浩特 010050）

牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）又称牛疱疹病毒Ι型（bovine herpes virus type 1，BoHV-1），是 具有囊膜的双链DNA 病毒，基因大小约138 kb，编码70 种蛋白，可引起以结膜炎和鼻气管炎为主要特征的牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）[1-2]。IBRV 是引起牛呼吸道疾病综合征（BRDC）的病原之一，通过呼吸道或生殖道急性感染宿主局部神经元并建立潜伏期，可自我激活或在应激和皮质类固醇治疗条件下被重新激活，随后通过呼吸道、眼部或生殖道分泌物以及感染公牛的精液传播[3-5]。IBRV 感染导致的直接生产损失主要表现为，奶牛产奶量降低、体重减轻以及继发性细菌感染所致的奶牛流产和不孕[6]。目前主要通过接种灭活或减毒疫苗对IBR 进行预防，以降低该病对畜牧业造成的经济损失，但这并不能有效预防IBR[7]。现研究人员正尝试使用亚单位疫苗、缺失或重组疫苗来控制或根除该病。

在IBRV 结构蛋白中，gI 蛋白位于囊膜，在病毒传播、扩散、与宿主细胞融合以及诱导宿主免疫应答中发挥重要作用[8]。gI 蛋白由IBRVUs7所编码，包括一个信号肽区域。虽然IBRV 核衣壳和囊膜结构已经被广泛研究，但IBRV 核衣壳和囊膜中多数蛋白质的特征尚不清楚[9]。本研究以IBRVgI基因作为研究对象，通过在线软件对gI 蛋白信号肽、跨膜区、抗原决定簇位点、亲水性和二级结构进行了预测，去除其信号肽序列，设计了扩增gI截短型基因的PCR 引物，然后通过PCR 方法获得gI截短基因序列，构建原核表达质粒，通过表达和纯化具有生物学活性的gI 蛋白，成功制备了抗IBRV gI 蛋白的单克隆抗体（以下简称“单抗”）。本研究为IBRV 诊断试剂研制和深入研究gI 蛋白抗原表位及蛋白功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、载体、细胞和血清 IBRV NM14毒株、MDBK 细胞、COS-7 细胞、EGFP 质粒和pET-32a 载体，由内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室保存；pMD19-T 载体，购自大连宝生物工程有限公司；DH5α 感受态细胞、BL21（DE3）感受态细胞，购自天根生化科技有限公司；SP2/0 细胞，购自奥陆生物公司（上海）；IBRV 阳性血清，为实验室鉴定临床血清样品后保存。

1.1.2 试剂及试验动物 DNA Marker，购自大连宝生物工程有限公司；T4 连接酶，购自NEB 公司；限制性内切酶（BamH I/XhoI）、180 ku Prestained Protein Ladder、ECL 显影液，购自Thermo Fisher Scientific 公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自OMEGA 公司；Ni-IDA 6FF 预装重力柱，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；卡那霉素、YA1044 型透析袋，购自Solarbio公司；Anti-His Antibody，购自天根生化科技有限公司；HRP 标记的兔抗鼠IgG 抗体、FITC 标记的羊抗鼠IgG 抗体、FITC 标记的兔抗牛IgG 抗体，购自Abcam 公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，购自SIGMA 公司；5 周龄SPF 级BALB/c 雌性小鼠，购自维通利华公司（北京）。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参考GenBank 公布的IBRV gI蛋白序列（登录号：NP_045371.1），使用软件对IBRV gI 蛋白信号肽区域、跨膜区域、抗原决定簇位点、亲水性和二级结构进行预测。经生物信息学分析后选取截短表达区域，并使用BLAST 对截短表达区域进行同源性比对。根据截短表达区域的单克隆酶切位点情况和pET-32a 质粒多克隆酶切位点区域情况，利用Primer Premier 5.0 软件和DNAstar 7.1 系列PrimerSelect 软件设计引物。上游引物（IBRV-gI-F）：5'-CGCGGATCCATGCCGCGCGT CGCGAAC-3'；下游引物（IBRV-gI-R）：5'-CCGC TCGAGCGAGCCCGCTCTCGTCG-3'。下划线处为BamH I、XhoI 酶切位点，预计扩增目的片段大小约474 bp。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.2 重组质粒构建及鉴定 提取实验室保存的IBRV NM14 病毒基因组DNA，以其为模板对IBRVgI截短基因进行PCR 扩增并添加ployA 尾；PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，参照DNA 胶回收试剂盒说明书回收DNA，回收产物用BamH I 和XhoI 进行双酶切，然后利用T4 DNA 连接酶将其连接至pMD19-T 载体转化DH5α 感受态细胞；经PCR、双酶切鉴定后，将鉴定正确的重组质粒与pET-32a 载体用BamH I 和XhoI 酶切、回收并连接，转化至BL21（DE3）感受态细胞；PCR、双酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时将质粒送往上海生工生物科技有限公司测序验证，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-32a-gI。以相同方法构建真核表达质粒pcDNA3.1-gI。

1.2.3 重组蛋白可溶性分析及纯化 将pET-32a空载体菌液和鉴定成功的pET-32a-gI 阳性菌液在恒温振荡培养箱中37 ℃、200 r/min 活化3 代，各取200 μL 菌液接种至20 mL 含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中，培养至菌液处于对数生长期（OD600nm=0.6～0.8）；分装10 mL 菌液作为阴性对照，剩余10 mL 菌液添加100 mmol/L 的IPTG溶液至其终浓度为1 mmol/L，在恒温震荡培养箱中16 ℃、100 r/min 培养12 h 后收集菌泥；将菌泥用PBS 清洗3 次，以超声波破碎（35%工作效率，超声5 s，暂停10 s），4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，分离上清与沉淀；将上清蛋白与镍柱结合，使用含不同浓度咪唑的洗脱液对表达蛋白进行纯化，收集流穿液；流穿液与蛋白上样缓冲液混匀，100 ℃金属浴10 min，进行SDS-PAGE 电泳。

1.2.4 单抗制备 将表达纯化的gI 蛋白免疫4 只SPF 级BALB/c 雌性小鼠，制备IBRV gI 蛋白单抗。首先将gI 蛋白与弗氏完全佐剂乳化后进行初次免疫，免疫蛋白量为50 μg/只；两周后，将gI 蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行二次加强免疫，免疫蛋白量为30 μg/只；两周后，对所有小鼠通过眼眶静脉丛采血并分离血清，采用间接ELISA 检测血清效价，当血清效价达到规定值后，进行细胞融合；在细胞融合前3 d，将gI 蛋白腹腔注射免疫小鼠（50 μg/只），采用PEG 法将小鼠脾细胞与SP2/0 细胞融合，融合完成后以半固体培养基（含HAT）进行筛选；挑取细胞单克隆，培养于96 孔细胞板中，采用ELISA 方法进行第1 次筛选；根据间接ELISA 筛选数据，挑出阳性值较高的细胞孔，用DMEM 培养基悬浮进行细胞计数，吹匀后滴加至96 孔板；7～10 d 后在显微镜下观察，挑取阳性单克隆细胞继续进行筛选，用该方法连续亚克隆3 次，以保证能挑选出分泌高水平抗体且稳定传代的细胞株。利用体内诱生法制备抗IBRV gI 蛋白的单抗腹水。

1.2.5 Western blot 检测将被IBRV 感染的MDBK 细胞SDS-PAGE 电泳后，转印至PVDF 膜上，以5%脱脂奶于4 ℃封闭过夜；PBST 洗涤3 次，以本试验制备的单抗（1:500、1:1 000、1:2 500、1:5 000、1:10 000 稀释）为一抗4 ℃过夜孵育；PBST 洗涤3 次，以HRP 标记的兔抗小鼠IgG（1:8 000 稀释）为二抗，室温孵育1.5 h；PBST洗涤3次，加入显影液，在凝胶成像系统上分析结果。

1.2.6 间接免疫荧光（IFA）检测 将IBRV NM14 毒株按50 TCID50稀释度接种MDBK 细胞，24 h 后弃掉培养液，用PBS 洗涤3 次；以4%多聚甲醛室温固定15 min，0.5% Triton X-100 通透20 min，5% BSA 封 闭30 min，PBST 洗 涤3 次，用筛选的阳性单抗（1:100 稀释）4 ℃孵育过夜，IBRV 阳性血清（1:100 稀释）作为阳性对照；以FITC 标记的羊抗鼠IgG（1:2 000 稀释）37 ℃孵育1 h，阳性对照使用兔抗牛IgG（1:2 000 稀释）孵育；PBST 洗涤3 次，置于荧光显微镜下观察结果（以未接毒MDBK 细胞为阴性对照）。同时将gI14 单抗按原液以及1:10、1:50、1:100 和1:200 稀释液，用上述方法进行IFA 检测。

1.2.7 真核转染鉴定 参照Lip 3 000 转染试剂说明书，将重组质粒pcDNA3.1-gI 和EGFP 质粒转染COS-7 细胞，培养48 h 后对制备的gI 单抗进行IFA 鉴定，具体步骤参照1.2.6。

2 结果与分析

2.1 目的蛋白生物信息学分析

在线软件TMHMMM SERVERV 2.0 预测显示，该蛋白无跨膜区域（图1-A）；在线软件SignalP-5.0 预测显示，该蛋白在第20 和21 位氨基酸（aa）处为信号肽切割位点（图1-B）；DNAstar Protean 预测的抗原决定簇位点和亲水性见图1-C；SOPMA 软件分析结果（图1-D）显示，参与形成α-螺旋的aa 有144 个（占37.70%），参与延伸链形成的aa 有58 个（占15.18%），参与无规则卷曲结构的aa 有152 个（占39.79%），参与β-转角形成的aa 有28 个（占7.33%）。避开跨膜区域和信号肽切割位点，选择亲水性较强区域和抗原决定簇正分高处，最终确定截短表达区域为277～750 bp。

2.2 重组质粒pET-32a-gI 鉴定

pET-32a 质粒大小为5 900 bp，截短表达区域基因组为474 bp。重组质粒pET-32a-gI 经BamH I和XhoI 双酶切后，对酶切产物进行核酸凝胶电泳检测，出现大小约5 900 和474 bp 的2 个目的条带（图2-A），片段大小符合预期；对pET-32a-gI 质粒进行PCR 扩增，产物经核酸凝胶电泳检测，目的条带约为474 bp（图2-B）。pET-32a-gI 质粒测序信息Blast 比对结果显示，目的基因为IBRVgI基因，pET-32a-gI 质粒构建正确。

2.3 gI 重组蛋白诱导表达及可溶性分析

利用IPTG 初步探索诱导表达，经SDS-PAGE分析发现，IPTG 未诱导的重组菌液和IPTG 诱导后的空载体均未出现特异性条带，而IPTG 诱导后的pET-32a-gI 重组菌液出现了特异性条带，其大小约为34 ku，与预期蛋白相对分子质量大小相符，且表达的gI 重组蛋白主要为可溶性蛋白（图3）。

2.4 gI 重组蛋白纯化

将超声波破碎后收集的上清溶液挂镍柱后，分别用含10、50、100、200、300、400和500 mmol/L 咪唑的缓冲液洗脱，分别收集洗脱流穿液，以SDS-PAGE 电泳检测蛋白纯化效果。结果（图4）显示，300、400 mmol/L 咪唑洗脱缓冲液均可将目的蛋白洗脱下来，其中400 mmol/L 咪唑洗脱缓冲液得到的蛋白条带较为单一。经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，纯化蛋白质量浓度为876 µg/µL。

2.5 小鼠阳性血清效价测定及杂交瘤细胞筛选

采用间接ELISA 检测小鼠血清效价，待检血清孔与阴性对照孔OD450nm比值（P/N）＞2.1 时，血清的最高稀释度为血清抗体效价。结果（表1）显示，4 只免疫小鼠血清抗体效价均可达到1:51 200以上，可进行细胞融合。细胞融合后，采用间接ELISA 筛选出1 株稳定分泌gI 重组蛋白抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为gI14。利用抗原亲和纯化法对gI14 细胞上清进行纯化，纯化后的鼠单抗被鉴定为IgG 亚型。

表1 小鼠阳性血清ELISA 检测结果（OD450nm）

2.6 Western blot 检测

将纯化的gI 重组蛋白和被IBRV 感染的MDBK 细胞变性后电泳，随后转印至PVDF 膜，以制备的gI14 单抗为一抗，HRP 标记的兔抗鼠IgG 为二抗，孵育并显色。结果（图5）显示，纯化所得的gI 蛋白在约34 ku 处出现特异性条带，被IBRV 感染的MDBK 细胞在约45 ku 处出现特异性条带。结果表明，制备的单抗不仅能与纯化的gI 蛋白特异性结合，还可以与IBRV 产生的天然gI蛋白特异性结合。

2.7 IFA 检测

IBRV NM14 株感染MDBK 细胞后，以上述制备的gI14 单抗及IBRV 阳性血清为一抗，FITC标记的羊抗鼠和兔抗牛IgG 为二抗，进行IFA 检测。结果（图6）显示，阳性血清和gI14 单抗孵育后均有绿色荧光呈现，而阴性对照无荧光，表明gI14 单抗可以与病毒感染细胞产生的天然gI 蛋白特异性结合。同时将gI14 单抗稀释5 个梯度，进行IFA 检测。结果（图7）显示，稀释的gI14 单抗孵育后均有绿色荧光呈现，阴性对照则无荧光。

2.8 真核转染鉴定

将EGFP 质粒和pcDNA3.1-gI 质粒转染COS-7 细胞，进行IFA 鉴定。结果（图8）显示，孵育gI14 单抗的细胞孔和阳性质粒细胞孔均可观察到绿色荧光信号，而阴性对照孔未观察到荧光信号，表明gI14 单抗可与真核表达的gI 蛋白特异性结合。

3 讨论

据有关报道[10]，IBRV 在世界范围内广泛存在，大多数国家牛群中均可不同程度的检出IBRV抗体，其中包括少数至今还未分离出病毒的南美国家。IBRV 可潜在感染宿主，在宿主发生持续和周期性应激反应时导致发病，给养牛业造成巨大经济损失。IBRV 被世界动物卫生组织（WOAH）列为须通报动物疫病，因而一些欧洲国家制定了根除计划，措施包括疫苗接种、带毒牛隔离、边界控制和屠宰等[6]。我国于1980 年首次从国外进口的奶牛中检测出IBRV，自此许多研究人员开始对该病的流行病学进行调查，发现目前我国大部分省份存在IBRV 感染，且病例呈现逐年上升趋势[11]。

病毒糖蛋白在病毒颗粒结合和穿透宿主细胞过程中起到关键作用[12]。研究[13-15]表明，IBRV gC、gD、gE、gH、gL 和gK 蛋白是病毒侵入所必须的。近年来IBRV gE 蛋白成为研究热点，而与之相互作用形成Fc 受体的gI 蛋白却鲜有研究，其在病毒入侵中所扮演的角色有待探索。研究[16]表明，单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）糖蛋白复合物gE-gI 可介导病毒在相邻细胞之间的传播，这为HSV 传播分子机制解析提供了参考。此后，有学者研究[17]发现，IBRV gE 和gI 之间的相互作用可促进病毒在细胞间传播，而缺失gE 和/或gI 会影响病毒传播。因此，IBRV gI 蛋白极具研究价值。近年来，我国多个科研团队先后成功制备了IBRV gB、gC、gD、gE 和gG 蛋白单抗[18-22]，但gI 蛋白及其单抗研究相对较少。

IBRV gI 蛋白抗原性和免疫原性的研究，需大量重组蛋白和gI 蛋白单抗作为前提条件。表达的IBRV gI 蛋白相对分子质量约34 ku，主要以可溶性蛋白形式存在，利用杂交瘤技术成功制备出抗IBRV gI 蛋白的IgG 亚型单克隆抗体。本试验初步筛选出11 株阳性亚克隆细胞株，经过3 次后续亚克隆，最终仅筛选出1 株阳性杂交瘤细胞株。其原因可能是细胞克隆时染色体丢失，导致某些孔效价降低，或者非分泌抗体细胞抑制了阳性杂交瘤细胞株生长。此外，还通过构建真核表达载体pcDNA3.1-gI 表达真核蛋白。该蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能等方面接近天然蛋白分子，可将其作为一种检验手段鉴定gI 蛋白单抗。本研究为进一步研制IBRV 诊断试剂及研究IBRV gI 蛋白功能奠定了基础。