免疫增强剂CpG DNA 重组质粒对不同日龄SPF 鸡H9 亚型禽流感灭活疫苗免疫效应的影响

房立春，胡宇航，李月涛，刘 涛，亓丽红，吴家强，赵 鹏，朱鸿飞

（1.山东省农业科学院，山东济南 250100；2.河南科技学院，河南新乡 453003；3.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；4.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

免疫刺激是DNA 作为遗传物质之外的另一重要属性和功能[1]，一部分短的非表达序列DNA通常具有这种功能。这些普遍存在于细菌、病毒及非脊椎动物基因组中的特定短核苷酸序列，通常被称为CpG 免疫刺激序列[2]。已有试验[3]证明，化学方法合成的含有CpG-ODN（oligo deoxynucleotide，寡聚脱氧核昔酸）的重组质粒具有同细菌中含有CpG 基序的寡聚脱氧核苷酸（CpG DNA）相似的免疫刺激活性。CpG DNA 还能增强抗原特异性免疫应答，从而表现出强烈的佐剂活性，而且已在人和多种动物中获得证实[4-7]。

目前，大量试验[8-10]已证明，CpG DNA 能有效刺激活化多种家畜和家禽的免疫系统，而且体内试验已经证实，用大肠杆菌 CpG DNA 与鸡新城疫灭活疫苗同时接种鸡，能提高抗原的特异性免疫应答，诱导高水平保护性抗体。然而，CpG DNA对H9 亚型禽流感病毒（AIV-H9）灭活疫苗免疫效果增强作用的系统性试验鲜有报道。本研究应用商品化的含有CpG 基序序列即CpG DNA 的重组质粒作为AIV-H9 灭活疫苗佐剂，共同免疫不同日龄的SPF 雏鸡，观察其免疫效应，目的在于分析CpG DNA 对AIV-H9 灭活疫苗的免疫增强作用，为商品化的CpG DNA 作为疫苗免疫佐剂提供有价值的理论依据；同时根据不同日龄雏鸡初免后的抗体消长情况和外周血淋巴细胞CD4、CD8 分子的mRNA 表达水平，为AIV-H9 灭活疫苗联合使用CpG DNA 免疫增强佐剂的免疫程序提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 CpG DNA 分子免疫增强剂

CpG DNA 重组质粒购自南京太和生物技术有限公司，在配制评价用疫苗前进行适当稀释，使用剂量为每羽份40 μg。

1.2 抗原和主要试剂

AIV-H9 F 株灭活抗原，由中崇信诺生物科技研发项目部提供；AIV-H9 HA 抗原，购自青岛易邦生物工程有限公司；吐温、司本、白油佐剂（Marcol 52 白油），由淄博嘉驰石油化工有限公司提供。PBS 缓冲液，购自大连美伦生物技术有限公司。

1.3 试验动物

90 只SPF 鸡（1、7、21 日龄各30 只），购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.4 评价用疫苗制备

将白油与司本按94:6 的体积比，搅拌混合均匀后高压灭菌，121 ℃维持30 min；配置油相，冷却后备用；AIV-H9 灭活抗原与指定剂量的CpG DNA 免疫增强剂或生理盐水混合，将混合物与吐温按96:4 的体积比混合，200 r/min 搅拌5 min，使吐温完全溶解，配置水相；将油相300 mL（水相体积的3 倍）加入500 mL 高脚烧杯中，开动疫苗乳化机，200 r/min 转速搅拌，同时缓慢加入水相100 mL，升高转速至8 000 r/min 搅拌10 min。具体配苗比例见表1。

1.5 动物试验

对1、7 和21 日龄SPF 鸡各10 羽，分别免疫添加CpG DNA 佐剂的AIV-H9 灭活疫苗和未添加佐剂的AIV-H9 灭活疫苗，每羽颈部皮下注射0.5 mL，另各设10 羽作为空白对照，注射同剂量PBS 缓冲液。

1.6 HI 抗体测定

所有免疫的1 日龄与7 日龄SPF 鸡，在免疫3 周后，连续4 周，每周采集静脉血，分离血清，-20 ℃保存；所有免疫的21 日龄SPF 鸡，在免疫后每周采集静脉血，连续4 周分离血清，-20 ℃保存。血清样品同时按照《中国兽药典》中血凝抑制（HI）试验操作规程测定针对AIV-H9 的抗体。为尽最大可能避免操作误差，所有鸡的血清使用同一批次试剂，在相同条件下，由相同人员在同一次操作中进行检测。每个样品重复1 次，如果2 次差异较大则再次重复。

1.7 CD4、CD8 mRNA 表达水平测定

所有1、7、21 日龄的SPF 鸡在免疫3 周后，采集静脉血，参照岳华等[11]建立的RT-PCR 方法检测鸡CD4、CD8 基因表达水平，以鸡β-actin 作为内参，以未添加佐剂的AIV-H9 灭活疫苗组为对照，采用2-∆∆ct法[12]计算CD4、CD8 分子mRNA相对表达水平。

2 结果

2.1 不同日龄SPF 鸡免疫抗体消长比较

结果（表2～4）显示：SPF 鸡在21 日龄首次免疫，比在1 日龄和7 日龄免疫的效果更好。免疫疫苗后，各组针对AIV-H9 的抗体逐渐上升，21 日龄免疫组上升速度更快；在免疫添加CpG DNA 免疫增强剂疫苗情况下，1 日龄与7 日龄免疫的HI抗体峰值约为9log2，并且两组的HI 抗体滴度差异不显著（P＞0.05），21 日龄免疫的HI 抗体峰值约为11log2，与其他日龄相比增高约2log2 滴度，差异显著（P≤0.05）；21 日龄免疫的HI 抗体离散度小，均匀度优于1 日龄与7 日龄。

表2 1 日龄SPF 鸡免疫后不同时间HI 抗体消长规律

表3 7 日龄SPF 鸡免疫后不同时间HI 抗体消长规律

表4 21 日龄SPF 鸡免疫后不同时间HI 抗体消长规律

2.2 CpG DNA 免疫增强剂对HI 抗体的影响

不同日龄SPF 鸡初次免疫后不同时间点的HI抗体水平（表2～4）显示，免疫添加CpG DNA免疫增强剂的AIV-H9 灭活疫苗抗体滴度比未添加升高明显。1 日龄SPF 鸡免疫后第3～6 周，添加CpG DNA 免疫增强剂组比未添加组分别升高1.79log2、0.64log2、2.08log2、2.07log2，而且第5周和第6 周的HI 抗体滴度差异极显著（P≤0.01）；7 日龄SPF 鸡免疫后第3～6 周，添加CpG DNA 免疫增强剂组的HI 抗体滴度比未添加组分别升高2.23log2、2.40log2、1.28log2、1.26log2，差异均极显著（P≤0.01）；21 日龄SPF 鸡免疫后第1～4 周，添加CpG DNA 免疫增强剂组的HI 抗体滴度比未添加组分别升高0.72log2、2.71log2、2.20log2、1.01log2，除第1 周外，其他各时间点的HI 抗体滴度差异均极显著（P≤0.01）。在相同日龄免疫的情况下，添加CpG DNA 免疫增强剂疫苗组的HI 抗体峰值滴度更高，与未添加组相比，统计学差异极显著（P≤0.01），HI 抗体上升速度也更快，且高峰的维持时间更长（图1～2）。

2.3 CpG DNA 免疫增强剂对CD4、CD8 mRNA表达水平的影响

以未添加CpG DNA 免疫增强剂组雏鸡外周血淋巴细胞CD4、CD8 mRNA 表达水平为1，对比不同日龄SPF 鸡初次免疫后第3 周的外周血淋巴细胞CD4、CD8 mRNA 表达水平。结果（图3）显示：免疫添加CpG DNA 免疫增强剂组的CD4、CD8 mRNA 表达水平均高于未添加组，且7 日龄和21 日龄组的CD4 和CD8 基因表达水平明显高于1 日龄组（P≤0.01）；21 日龄免疫添加CpG DNA 免疫增强剂组的CD4、CD8 mRNA 表达水平均高于其他日龄组。

3 讨论

CpG DNA 作为一种安全、经济、有效的新型疫苗佐剂，具有其他佐剂无法比拟的优势[13]。国外学者Rankin 等[14]研究证实，CpG ODN 具有较好的安全性，使用剂量低，无毒副作用。另外CpG 基序还可诱导机体发挥先天性的抗病毒作用。目前，CpG 已成为人类医学和动物医学领域的研究热点，并显示出了广阔的应用前景。国内学者李杰等[15]利用CpG DNA 佐剂进行鸡新城疫活疫苗的免疫效果观察，结果发现CpG DNA 能显著增强鸡对新城疫LaSota活疫苗的体液和细胞免疫反应。

当前，进行疫苗免疫接种仍是我国防控禽流感的主要手段[16]。近年来，在我国部分省市规模化养殖场的禽流感调查[17]中发现，H9 亚型阳性鸡群占总禽流感抗体阳性鸡群的93.67%，证明H9 亚型禽流感仍然在我国广泛存在，并给养鸡场造成了巨大经济损失。因此，如何提高疫苗的免疫效果成为禽流感免疫防控中的重要研究课题。本研究首次将商品化的含有CpG DNA 重组质粒，配伍白油等制成AIV-H9 灭活疫苗，通过免疫不同日龄的SPF雏鸡，观察了CpG DNA 重组质粒对AIV-H9 灭活疫苗的免疫增强效应。

目前广泛认可，在HI 抗体滴度高于4log2 时，禽流感灭活疫苗具有较好的保护效果，因此较早地达到并超过这个滴度能极大减少鸡群感染禽流感病毒的风险。本研究发现：在CpG DNA 作用下，试验组HI 抗体滴度上升速度更快，21 日龄SPF 鸡免疫后第1 周AIV-H9 ＋CpG 组即达到了4.44log2，而未添加组仅为3.72log2，差异显著（P≤0.05）；免疫后第2 周AIV-H9 ＋CpG 组HI 抗体滴度为9.62log2，而未添加组为6.91log2，两组较第1 周分别上升了5.18log2 和3.19log2，AIV-H9 ＋CpG组表现出了更快的上升速度；在相同日龄免疫的情况下，添加CpG 免疫增强剂疫苗组的HI 抗体峰值滴度均高于未添加组，升高近2 个滴度，差异极显著（P≤0.01）并且高峰期维持时间更长，显示出更好的保护效果，能带给鸡群更好的抵抗病毒的免疫能力。这些都是评价疫苗优劣的重要指标。

另外，本研究对免疫含有CpG DNA 灭活疫苗的不同日龄SPF 鸡HI 抗体水平进行了初步探究。结果表明：在21 日龄进行CpG DNA 联合AIV-H9灭活疫苗免疫比在1、7 日龄免疫效果更好，不仅HI 抗体滴度更高而且离散程度小。1 日龄与7 日龄免疫效果差距不明显，对比差异不显著，其原因可能是低日龄免疫时其自身免疫系统尚未发育成熟。而CpG DNA 在提高HI 抗体水平上，主要是直接刺激B 细胞，减少B 细胞凋亡，还使B 细胞表面MHC Ⅱ类（major histocompatibility complex class II）抗原以及共刺激因子 B7-1、B7-2 表达量增加[18-19]，并且由于大日龄鸡的免疫系统相对成熟，所以其CpG DNA 的免疫增强效果更好。

CD4+T 细胞可与MHCII 类分子递呈的多肽抗原发生反应而被激活产生免疫反应，CD8+T 细胞可以识别MHCI 类（major histocompatibility complex class I）分子递呈的抗原，并直接杀死感染或变异细胞[20]。CD4+T 细胞与CD8+T 细胞的数量及状态反映了机体免疫力的高低[21-22]。本研究通过测定分析外周血淋巴细胞中 CD4 和 CD8 的基因相对表达水平，来评估机体细胞的免疫状态，初次免疫后，添加CpG DNA 免疫增强剂组的CD4、CD8 mRNA 表达水平均高于未添加组，且在21 日龄时差异水平最大。该结果说明，CpG DNA 免疫增强剂能够激活鸡免疫细胞，提高外周血T 淋巴细胞中CD4、CD8 的相对表达水平，间接表明免疫增强剂促进了T 淋巴细胞的增殖和分化，从而提高了机体的免疫水平。

本研究表明，CpG DNA 重组质粒能显著激活鸡的免疫系统，增强鸡对AIV-H9 灭活疫苗的特异性体液免疫应答，尤其对21 日龄鸡作用更明显。这提示，CpG DNA 重组质粒可作为禽流感灭活疫苗的高效免疫增强剂。本研究为CpG DNA 重组质粒在禽流感疫苗上的联合应用以及研制新型复合佐剂疫苗提供了依据。