盐酸贝那普利对TGF-β1诱导的子宫内膜上皮及间质细胞纤维化的保护作用研究

罗星雨，转 黎，胥 琴，田冀雯，马艳萍*

0 引言

宫腔粘连是指女性子宫内膜基底层受损，子宫内膜恢复障碍，临床表现为月经异常、闭经、流产、不孕等一系列综合征[1]。纤维化是宫腔粘连的主要病理改变，不同研究显示，终止妊娠后宫腔粘连发生率为8.1%～21.2%[2-4]。目前针对宫腔粘连的治疗最常采用和最有效的方法是宫腔镜下粘连分解术加术后雌、孕激素治疗，该方法在改善月经和提高妊娠率方面具有重要作用，但有部分研究表明，重度宫腔粘连的复发率可高达63%左右[5-6]。因此，寻找新的治疗药物及治疗方法仍然十分重要。有大量研究发现，血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)可以通过降低血管紧张素Ⅱ水平，从而调节体内TGFβ相关的mRNA水平，延缓多种器官纤维化进展，目前发现，ACEI类药物盐酸贝那普利可以通过调节TGF-β参与的信号通路延缓肾、肝、肺等器官的纤维化进展[7-10]，TGF-β作为始动因子主要参与TGF-β1-smad2/smad3信号通路途径，当损伤发生时TGF-β表达增加，该信号通路活化，纤维化发生[11-12]。本研究选取人子宫内膜上皮细胞(AN3CA)及人子宫内膜间质细胞(hESC)，用TGF-β1诱导其纤维化改变，给予盐酸贝那普利治疗，观察盐酸贝那普利对TGF-β1诱导的AN3CA细胞及hESC细胞纤维化改变的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 TGF-β1蛋白购于Sinobiological公司；盐酸贝那普利、Cell Counting Kit-8(CCK8)购于MedChemExpress公司；AN3CA细胞、hESC细胞购于赛百慷生物技术股份有限公司(中国上海)；MEM培养基、DMEM/F-12培养基、胎牛血清FBS、0.25% Trypsin-EDTA购于GIBCO公司(美国)；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于Solarbio公司；CellTiter-Glo细胞活力检测系统购于Promega公司；Anti-Fibronectin antibody ab2413抗体、Anti-TGFβ1 antibody ab170874抗体购于Abcam公司；Smad3(C67H9)Rabbit mAb 9523抗体购于Cell Signaling Technology公司；KPL CyTM3-Labeled Antibody to Rabbit IgG(H+L)二抗购于Seracare公司；荧光倒置显微镜(Carl zeiss Microscopy GmbH，型号：Axio Scope A1)；流式细胞仪(BD公司，型号：JANUARY 2007)；酶标仪(BioTek公司，型号：ELX800)。

1.2 实验方法

1.2.1 预实验和实验分组 预实验用CCK8检测TGF-β1对AN3CA细胞的50%抑制率(IC50)，将细胞接种于96孔板，与不同浓度的TGF-β1共培养，按CCK8说明书方法进行细胞增殖活力测定，分别在24 h、48 h、72 h检测细胞增殖活力；用CCK8检测盐酸贝那普利对AN3CA细胞的安全浓度，将细胞接种于96孔板，与不同浓度的盐酸贝那普利共培养，按CCK8说明书方法进行细胞增殖活力测定，分别在24 h、48 h、72 h检测细胞增殖活力。将冻存的AN3CA细胞及hESC细胞复苏后，AN3CA细胞培养于MEM(含10%FBS)培养基，hESC细胞培养于DMEM/F-12(含10%FBS)培养基，培养条件37 ℃，5%CO2。细胞传代2次正常培养24 h后,将其分为对照组、实验组、BNPL5组和BNPL8组，对照组更换正常培养基(含10%FBS)，实验组更换含TGF-β1 5 ng/ml的培养基(含10%FBS)，BNPL5组更换含TGF-β1(5 ng/ml)+贝那普利(5 μmol/L)的培养基(含10%FBS)，BNPL8组更换含TGF-β1(5 ng/ml)+贝那普利(8 μmol/L)的培养基(含10%FBS)，AN3CA细胞培养48 h后终止培养，hESC细胞培养72 h后终止培养。

1.2.2 细胞形态学观察 用倒置相差显微镜观察细胞数量、细胞生长情况以及细胞形态改变。

1.2.3 CellTiter-Glo法测定细胞活力 按说明书方法测定细胞增殖活力，分别在0 h、24 h、48 h和72 h检测细胞增殖活力。

1.2.4 细胞凋亡水平检测 四组细胞终止培养后，制备细胞悬液，按凋亡试剂盒说明书方法应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 免疫荧光法测定纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)含量 将细胞按一定密度接种于24孔板专用细胞爬片，根据分组给予相应药物处理后终止培养，按一抗Anti-Fibronectin antibody及二抗KPL免疫荧光说明书方法进行免疫荧光检测，应用倒置相差荧光显微镜观察及拍摄，用Image J进行免疫荧光图片定量分析。

1.2.6 Western blot检测FN、TGF-β1、Smad3蛋白 按BCA蛋白测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，并制胶，加样，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转膜到PVDF膜上，使用5%BSA室温封闭1.5 h后,加入TGF-β1(1∶1 000)、Smad3(1∶1 000)、Fibronectin(1∶500)和GAPDH(1∶2 000)的抗体在4 ℃孵育过夜，洗膜后用过氧化物酶连接的二抗孵育1.5 h后，用增强化学发光法显示蛋白条带，然后检测灰度值，采用Image J图像分析软件计算目的蛋白的相对表达量，实验重复3次。

2 结果

2.1 CCK8筛查TGF-β1的IC50及盐酸贝那普利的安全浓度 AN3CA细胞与TGF-β1共培养48 h时实验组的抑制率为51%，故取TGF-β1的IC50(5 ng/ml)为实验组药物浓度(见表1)。当盐酸贝那普利的浓度≤8 μmol/L时，AN3CA细胞的存活率基本不受影响，且细胞形态无改变，生长状态好。当浓度>8 μmol/L时，AN3CA细胞的存活率下降，故考虑盐酸贝那普利的安全浓度≤8 μmol/L，故选取盐酸贝那普利浓度5 μmol/L和8 μmol/L为治疗浓度(见表2)。

表1 CCK8检测TGF-β1对AN3CA细胞的抑制率(n=3)

表2 CCK8检测AN3CA细胞的存活率(n=3)

2.2 盐酸贝那普利对TGF-β1诱导的AN3CA细胞及hESC细胞的形态学影响 终止培养后，荧光镜下结果显示，AN3CA细胞：对照组的细胞生长状态好，呈多角形或短梭形，贴壁牢靠，细胞数量多；实验组的细胞呈长梭形，纤维化样外观，贴壁不牢靠，活细胞数量较少，死亡细胞较多，细胞间隙大，形态学改变明显；BNPL5组的细胞部分恢复为短梭形或多角形，死亡细胞数较B组减少；BNPL8组的细胞部分恢复为短梭形或多角形，细胞死亡数较BNPL5组更少(图1)。hESC细胞：四组细胞形态均无明显改变，实验组细胞数量增多，BNPL5组细胞数量较实验组下降，BNPL8组进一步下降(图2)。

图1 AN3CA细胞形态图(400×)注：A.对照组；B.实验组；C.BNPL5组；D.BNPL8组

图2 hESC细胞形态图(400×)注：A.对照组；B.实验组；C.BNPL5组；D.BNPL8组

2.3 盐酸贝那普利对TGF-β1诱导的AN3CA细胞及hESC细胞增殖的影响 CellTiter-Glo法根据上述分组检测细胞增殖活力：AN3CA细胞用TGF-β1处理后细胞增殖活力下降，实验组与对照组有显著性差异，加用贝那普利处理后细胞增殖活力增加，差异无统计学意义(表3)；hESC细胞用TGF-β1处理后增殖活力增加，实验组与对照组有显著性差异，加用贝那普利后细胞增殖活力下降，BNPL8组与实验组在处理72 h差异有统计学意义(实验组：781 632.3±2 089.2，BNPL8组：668 127±17 293，P<0.001)(表4)。

表3 AN3CA细胞CellTiter-Glo测定结果

表4 hESC细胞CellTiter-Glo测定结果

2.4 盐酸贝那普利对TGF-β1诱导AN3CA、hESC细胞凋亡的影响 AN3CA细胞：与对照组相比，加用TGF-β1处理后AN3CA细胞凋亡率增加，使用盐酸贝那普利8 μmol/L处理后细胞凋亡率下降，差异具有统计学意义(表5，图3)。

图3 AN3CA细胞凋亡图注：A.对照组;B.实验组;C.BNPL5组;D.BNPL8组

表5 AN3CA细胞凋亡率

hESC细胞：与对照组比较，加用TGF-β1处理后细胞凋亡情况无明显变化。使用盐酸贝那普利8 μmol/L共培养后，细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义(表6，图4)。

图4 hESC细胞凋亡图注：A.对照组；B.实验组；C.BNPL5组；D.BNPL8组

表6 hESC细胞凋亡率

2.5 盐酸贝那普利对TGF-β1诱导AN3CA、hESC细胞的FN含量的影响 AN3CA细胞：根据分组处理4组细胞，终止培养后用免疫荧光法检测FN表达量，实验组FN表达量较对照组显著增加(P<0.001)，BNPL8组表达量较实验组降低(P<0.001)(表7，图5)。

表7 AN3CA细胞FN测定表

图5 AN3CA细胞FN免疫荧光图(100×)注：A.对照组；B.实验组；C.BNPL5组；D.BNPL8组

hESC细胞：终止培养后用免疫荧光法检测FN表达量。实验组FN表达量较对照组增加，差异有统计学意义。BNPL8组FN表达量较实验组降低，差异具有统计学意义(表8，图6)。

图6 hESC细胞FN免疫荧光图(免疫荧光，100×)注：A.对照组;B.实验组;C.BNPL5组;D.BNPL8组

表8 hESC细胞免疫荧光FN测定表

2.6 盐酸贝那普利对TGF-β1诱导的AN3CA、hESC细胞的FN、TGF-β1、smad3蛋白含量的影响 根据分组分别处理4组细胞，终止培养后应用Western blot检测FN、TGF-β1、smad3的蛋白表达情况，结果显示，2种细胞实验组FN、TGF-β1、smad3含量较对照组均显著增加，差异具有统计学意义。BNPL5组、BNPL8组较实验组FN、TGF-β1、smad3均有明显降低(表9～表10，图7～图8)。

表9 AN3CA细胞Western blot测定表

表10 hESC细胞Western Blot测定表

图7 AN3CA细胞FN、TGF-β1、smad3的Western blot检测灰度图

图8 hESC细胞FN、TGF-β1、smad3的Western blot检测灰度图

3 讨论

TGF-β1-smad2/smad3途径是参与子宫内膜纤维化的主要信号通路之一，TGF-β作为该通路的配体，结合细胞表面的1型和2型受体，即丝/苏氨酸激酶，触发信号转导至2型受体，使1型受体磷酸化激活R-smad(smad1、2、3、5、8)，R-smad结合到Co-smad的结合位点上，从而使信号分子能跨越细胞核膜，将信息传递到细胞核内，从而调节目的基因的转录[13]，正常情况下该通路维持一个动态平衡，TGF-β1为该通路的始动因子，smad3是该信号通路的下游因子。有研究发现，应用SD大鼠进行宫腔搔刮构建宫腔粘连模型后，其TGF-β1及smad3蛋白表达增加，表明smad3蛋白的过度表达在子宫内膜纤维化进展中可能发挥重要作用[14]；纤维连接蛋白(FN)是细胞外基质的主要纤维成分之一，目前发现子宫内膜上皮细胞及子宫内膜间质细胞均可分泌纤维连接蛋白，其中间质细胞分泌纤维连接蛋白的作用更加明显，它们的共同作用参与子宫内膜纤维化的进展；目前，纤维连接蛋白被认为是纤维化程度的判断因子[15]，当子宫内膜纤维化发生时，上皮细胞-间质化的比例增加，上皮细胞转化为间充质细胞，其分泌纤维连接蛋白的能力随之增加，称为上皮-间充质转换(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)，EMT有助于纤维化的发展[16]。

目前大量研究认为,血管紧张素II(Angiotensin II,ATII)可能作为TGF-β1-smad2/smad3信号通路的上游因子调控纤维化[17-18]，并且有大量研究证明ACEI类药物可以通过TGF-β1参与的信号通路改善肾、肺、肝等脏器的纤维化[7-9,19]。本实验应用TGF-β1诱导AN3CA细胞及hESC细胞纤维化，并给予盐酸贝那普利作用于2种细胞，拟探索ACEI类药物盐酸贝那普利对人子宫内膜细胞纤维化的影响。结果显示，AN3CA细胞用TGF-β1处理后，细胞形态呈纤维化样改变，细胞活力降低，用贝那普利处理后，细胞活力部分恢复(虽然CellTiter-Glo显示并无统计学意义，但可以看到使用盐酸贝那普利后细胞的增殖活力呈现上升趋势)，细胞形态部分逆转，FN、TGF-β1以及smad3蛋白在给予盐酸贝那普利治疗后表达量均较TGF-β1损伤组显著下降；用TGF-β1诱导hESC细胞后细胞形态无改变，但细胞增殖活力增强，盐酸贝那普利抑制了TGF-β1处理后的hESC细胞增殖活力(CellTiter-Glo显示，使用盐酸贝那普利后细胞的增殖活力下降，且具有统计学意义)，增加了该细胞的凋亡水平，并且盐酸贝那普利治疗组FN、TGF-β1以及smad3蛋白表达量均显著低于TGF-β1处理组。子宫内膜主要由腺体发挥正常生物学功能，腺体由子宫内膜上皮细胞构成，子宫内膜上皮细胞参与子宫内膜的再生和修复，有利于抵抗炎症和纤维化，而子宫内膜间质细胞主要参与炎症、纤维化的发展。本结果显示，TGF-β1可降低AN3CA细胞的增殖活性，增加凋亡，降低其正常生物学活性，使子宫内膜上皮细胞发生炎症和纤维化；TGF-β1诱导后，hESC细胞的增殖活性增加，使其参与炎症和纤维化进展的功能增强。因此，本研究证明，TGF-β1同时促进了AN3CA细胞和hESC细胞的纤维化进展。盐酸贝那普利可以通过促进TGF-β1损伤后的AN3CA细胞的增殖活力降低其凋亡水平，并降低FN、TGF-β1、smad3蛋白表达水平，从而保护TGF-β1诱导纤维化的AN3CA细胞，延缓其纤维化进展；同时盐酸贝那普利可以通过抑制TGF-β1处理后hESC细胞的增殖活力增加其凋亡水平，并降低其FN、TGF-β1、smad3蛋白表达水平，从而降低hESC细胞的生物学功能，延缓其纤维化进展。因此，研究证明盐酸贝那普利同时改善了AN3CA细胞及hESC细胞的纤维化改变。

宫腔操作后子宫内膜损伤是临床上宫腔粘连的主要原因，在宫腔操作前或操作后给予患者安全浓度的贝那普利处理，是否可以降低患者的宫腔粘连率仍需要进一步探索。