CD68巨噬细胞浸润对原发性食管小细胞癌预后的影响

张玉铃，刘迪填，陈春发

(1.汕头大学医学院附属肿瘤医院医疗质量管理科，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院附属肿瘤医院胸部外科，广东 汕头 515041；3.汕头大学医学院附属肿瘤医院乳腺中心，广东 汕头 515041)

食管癌是恶性实体肿瘤之一，在所有癌症中其发病率居第7 位，死亡率居第6 位。原发性食管小细胞癌(primary esophageal small cell carcinoma，PESC)是最为常见的肺外小细胞癌。根据2019年世界卫生组织的分类，PESC 是神经内分泌癌一种亚型[1]，是一种少见的侵袭性恶性疾病。1952 年，McKeown 等[2]首次报道了PESC，主要发生在食管中下节段，约占我国所有食管肿瘤的0.36%～2.81%[3]，其临床表现与食管鳞癌及腺癌相似。但与鳞癌、腺癌相比，其生长更快、侵袭性更强，早期便可出现淋巴结转移和血行转移，因此预后也更差。由于其罕见性和缺乏前瞻性研究，目前尚缺乏标准的治疗方案和预后标记物。

越来越多的研究显示，巨噬细胞在不同肿瘤微环境的刺激下发生的活化性质不尽相同，其表达的表型及各自发挥的功能也不相同，使得肿瘤患者出现不同的疾病发展和转归。对于这些浸润在肿瘤中的巨噬细胞，我们将其统称为肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated macrophages，TAMs)。目前认为浸润在肿瘤中的巨噬细胞按不同的活化状态主要分为2 种类型：①M1型，又称经典活化的巨噬细胞，具有抑制和杀伤肿瘤细胞的作用；②M2型，又称替代性活化的巨噬细胞，可以促进肿瘤细胞的浸润和转移，进而促进肿瘤疾病的进展[4-5]。TAMs与PESC临床病理指标的相关性尚缺乏充分的研究，近来研究表明，CD68是一种可用于标记M1、M2 型巨噬细胞的标志物，而CD163 是一种可特异性识别M2 型巨噬细胞的标志物[6-7]。因此本研究采用CD68 与CD163 分别标记巨噬细胞，尝试了解M1及M2型TAMs在PESC中的浸润情况，并分析其与PESC的临床病理指标及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 临床病例及标本

收集汕头大学医学院附属肿瘤医院2000年1月—2019 年12 月有完整临床病理资料的PESC 患者手术切除组织标本。该研究已获得汕头大学医学院附属肿瘤医院医疗技术医学伦理审查委员会的审查批准通过(批准文号2019030)。患者或其家属同意参与该研究并签署知情同意书。所有患者在手术前均未接受任何治疗，首次治疗为食管部分切除并颈内食管胃吻合术及区域淋巴结清扫，术后分期根据美国癌症联合会2017年第8 版TNM 分期标准进行[8]。本研究共收集标本69例，其中男性49例，女性20例，年龄44～76岁，中位年龄61岁。

1.2 主要抗体和试剂

鼠抗人CD68 及CD163 单克隆抗体，DAB 显色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术公司产品。

1.3 免疫组织化学染色及结果判定

免疫组化EnVision 二步法操作步骤参照试剂盒说明书进行。CD68阳性巨噬细胞以细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为标记，CD163 阳性巨噬细胞则以细胞膜或细胞质呈现黄褐色或棕褐色颗粒为标记。计数CD68和CD163 巨噬细胞数量的方法参考本课题组已发论文[9]，在低倍镜(×100)下观察整张切片，选取阳性细胞最密集区，利用LEICA数字图像采集系统于高倍视野(×400)下选取5～10 个阳性细胞最密集部位拍照，计算每张不重叠照片内阳性细胞数并取平均值代表该例标本瘤内浸润巨噬细胞计数值，选择中位数为高、低浸润分组的截断点[10-11]。

1.4 随 访

从患者术后出院起开始随访，主要采用门诊及电话随访，随访截止时间为2021 年12 月或死亡，生存时间从患者手术之日起至最后随访时间或死亡时间，死亡不包括意外死亡者。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26统计学软件进行统计分析，CD68和CD163 巨噬细胞浸润情况与患者临床病理指标关系的分析采用卡方检验和Fisher 精确检验，Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox 回归分析各变量与预后的关系，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PESC组织中CD68、CD163巨噬细胞浸润情况

免疫组化染色显示CD68 及CD163 为胞质或胞膜染色，在肿瘤组织中可见胞质中出现明显棕黄色或棕褐色颗粒的细胞浸润，这部分细胞就是TAMs(图1)。PESC 组织中CD68、CD163 巨噬细胞浸润密度平均每个视野为(16.1±7.9)个和(10.5±5.1)个，中位数分别为15.0 个 和9.3 个。CD68 高 浸润组36 例(52.2%，36/69)，CD163高浸润组织占35例(50.7%，35/69)。

图1 食管小细胞癌组织中CD68和CD163巨噬细胞的浸润情况(IHC，×400)

2.2 CD68、CD163巨噬细胞浸润情况与PESC临床病理指标的关系

如表1所示，CD68巨噬细胞除了与肿瘤T分期有关(χ2=6.336，P=0.012)外，与其他临床病理指标均无统计学相关。T1-T2 分期的PESC 患者中CD68 巨噬细胞高浸润情况更常见。而CD163巨噬细胞与各临床病例指标均无统计学相关。

表1 CD68、CD163巨噬细胞与食管小细胞癌临床病理指标的关系

2.3 PESC总体生存情况及影响因素分析

69 例患者生存时间为2～209 个月，中位生存时间21个月。按不同临床病理指标分类的患者中位生存期和总生存期如表2 所示，其中pTNM 分期、手术淋巴结清扫数目、N分期、辅助性化疗、CD68巨噬细胞浸润情况对中位生存期均有影响(组间差异均有统计学意义，P<0.05)。其中，PESC原发灶中CD68巨噬细胞高浸润的患者预后更好(图2)。

表2 食管小细胞癌患者生存分析

图2 食管小细胞癌组织中CD68和CD163巨噬细胞浸润的生存分析

2.4 PESC患者预后的多因素分析

将表2 中Kaplan-Meier 生存分析中具有统计学意义的指标pTNM 分期、手术淋巴结清扫数目、N 分期、辅助性化疗、CD68巨噬细胞等参数分别纳入多因素Cox 回归分析，结果发现pTNM 分期、手术淋巴结清扫数目、CD68 巨噬细胞浸润是PESC 患者独立的预后影响因素(表3)。CD68 巨噬细胞的浸润程度与患者的预后显著相关[风险比=0.340，95%置信区间(0.179，0.645)，P=0.001]，CD68巨噬细胞高浸润组的患者死亡风险降低约66%。

表3 PESC患者预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

在PESC 的发生发展过程中，肿瘤免疫微环境起着关键作用。其中，起源于外周血单核细胞的TAMs是肿瘤免疫微环境的重要组成部分。作为肿瘤微环境中的免疫调节细胞，TAMs 可极化成M1 或M2 表型，细胞表型的不同可导致不同的细胞因子分泌和功能的变化[12]。一般认为M1型TAMs 具有限制肿瘤生长的功能[13]，而M2型TAMs 更多的是与血管生成和肿瘤进展有关[14]。常用检测TAMs 相关表面标志物包含CD68、CD206 和CD163 等等。目前缺乏标记M1 型巨噬细胞的特异性标记物，一般认为CD68可作为巨噬细胞M1型的标记物[15]。与常用于标记M1 型巨噬细胞的CD68相比，特异性标记CD163 检测M2 型细胞对巨噬细胞具有更强的针对性，故CD163 可作为M2 型巨噬细胞高特异性标志物[16]。

本研究中，我们用CD68、CD163分别标记巨噬细胞，分析其与PESC 临床病理指标间的关系，结果发现仅CD68巨噬细胞浸润与肿瘤的T分期相关，T1-T2分期中的CD68 巨噬细胞浸润密度更高。而CD68、CD163 巨噬细胞浸润的情况和其他临床病理指标均无统计学意义。在临床上，恶性肿瘤的T 分期越早的患者往往具有更好的预后结果，这可能预示着高浸润CD68 巨噬细胞的PESC 患者可能具有更好的生存结果。鉴于CD68 常常被作为M1 型巨噬细胞的标记物，我们推测以M1 型巨噬细胞为主的CD68 巨噬细胞浸润，在早期PESC 抗肿瘤中起着重要作用。而CD163巨噬细胞与各病理指标间均无明显相关，这点与以往其他恶性肿瘤的相关研究不符[17-18]。一方面可能与本实验PESC 例数少有关，另一方面也有可能CD163 巨噬细胞在不同的恶性肿瘤所起的作用不一样，需要扩充样本量以及进一步的研究确认。

本研究的多因素Cox回归分析结果显示，pTNM分期、手术淋巴结清扫数目、CD68巨噬细胞表达是影响患者预后的独立因素，CD68巨噬细胞浸润密度高的患者生存期较长。这与之前报道的在前列腺、肺和脑肿瘤中的情况相符[19]。另外生存曲线显示CD163 巨噬细胞高浸润患者与低浸润患者的预后差异无统计学意义，该结果与其他实性肿瘤如宫颈癌、食管鳞癌、乳腺癌等相左[11，20-21]，这可能与本实验例数相对较少有关，也有可能与CD163巨噬细胞在不同类型的恶性肿瘤中的作用不一致有关。

虽然CD68是一种可用于标记M1、M2型巨噬细胞的标志物，但目前有研究支持CD68可作为M1型巨噬细胞的标记物[15，21]。结合本研究的结果，我们推测在PESC 组织中浸润的CD68 巨噬细胞以具有抗肿瘤作用的M1 型巨噬细胞为主。当然，还需要寻找更具有特异性M1型巨噬细胞标记物的实验进一步验证。

在PESC 治疗上尚缺乏前瞻性随机对照临床研究及治疗规范，手术是PESC 局部控制的常用手段，而后续联合化疗可以进一步改善患者预后[22]。我们的研究结果也显示术后接受化疗的患者预后优于未化疗的患者，最近的研究结果也支持化疗明显提高PESC 患者的生存[23]。另外，基于前面提到的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞在肿瘤中作用的不同，是否可以通过调控TAMs表型转化，使肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞向M1 型转化，达到有效地抑制肿瘤细胞增殖和发展而起到治疗作用，这将会是一个很有意义的研究方向。

综上所述，高浸润的CD68巨噬细胞是PESC患者的独立预后因子，CD68巨噬细胞高浸润的患者预后明显优于CD68巨噬细胞低浸润的患者。