基于Toll 样受体信号通路威灵仙总皂苷对类风湿关节炎大鼠踝关节病理学改变影响

赵守彰， 孙秀业

1. 辽宁医药职业学院，辽宁 沈阳110101；2. 辽宁中医药大学附属第二医院 康复科，辽宁 沈阳110801

类风湿性关节炎(rlaeumatoidarthritis，RA)属于自身系统性免疫疾病，其主要病理改变包括关节滑膜炎性细胞浸润，血管翳形成，骨组织侵蚀，骨关节被破坏等[1-3]。 目前，RA 的治疗依旧以非甾体类抗炎药、肾上腺皮质激素及抗风湿性药物为主，但以上药物均不能从本质上解决问题，且长期服药所带来的不良反应也严重影响疾病的治疗效果[4]。 威灵仙是我国传统中药材，具有祛风除湿、通络止痛之效，威灵仙内含有丰富的皂苷类物质，威灵仙总皂苷(total saponins of clematis，TSC)在抗炎止痛、调节免疫中具有良好的临床效果，但关于TSC 在治疗RA 中的具体机制尚处于研究阶段[5-6]。 Toll 样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路是RA 发生发展中的重要通路，TLR 广泛表达于天然免疫细胞与特异性免疫性细胞表面，主要通过髓样分化蛋白(myeloid differential protein-88，MyD88)依赖途径，激活核转录因子-κB(nuclear transcription factorkappa B，NF-κB)，释放炎性细胞因子与活化蛋白C，促进RA 进展[7-8]。 本研究旨在探讨TSC 是否可通过TLR 信号通路发挥治疗功效。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取60 只SD 雄性大鼠，体质量(200 ±20)g，购自成都可恩生物科技有限公司，动物许可证号:SYXK(川)2021-235。

1.2 试剂及药品 完全弗氏佐剂(SIGMA 公司)、苏木素染液(珠海贝索生物公司)，水合氯醛、75%酒精、甲醛溶液、乙醇、二甲苯等试剂均购自江莱生物有限公司，白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)酶联免疫试剂盒购自上海源叶生物技术有限公司，DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TLR4、MyD88、NF-κB p65 抗体购自英国Bioss。 实时荧光定量PCR 引物由南京Realgene 生物技术有限公司合成。 TSC 购自陕西宝鸡宣威生物技术有限公司，经UV 检测含量为90.7%，阳性对照药物甲氨蝶呤购自上海信谊药厂。

1.3 仪器及设备 HERASE 型离心机(德国)、2H12003 型显微镜购自日本奥林巴斯光学有限公司、EG1160 型生物组织自动包埋机购自德国LEICA 仪器有限公司，EPS 300 型电泳仪、VE-180型电泳槽、VE-186 型转膜仪均购自上海天能公司，DNP-9052 BS-Ⅲ型恒温箱购自上海三发公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及模型建立 (1)动物分组:将60 只雄性SD 大鼠随机分为6 组，分别为空白对照组、RA 模型组、阳性药物对照组及TSC 低、中、高组，每组各10 只。

(2)RA 模型大鼠建立:适应性喂养1 周后，除空白对照组外，其余大鼠经左后足跖皮内注射FCA 0.1 ml 进行建模，具体操作参照文献[9]，取1 g/L的FCA 溶液1.5 ml 与等体积2 g/L 的胶原溶液，3 000 r/min搅拌3 min 形成稳定乳液，利用注射器向大鼠左侧踝关节处注射0.1 mol/L 的乳液，10 d后，注射胶原与不完全佐剂混合乳液0.05 ml 加强免疫。 造模成功标准:24 h 内，大鼠足部出现急性炎症反应性肿胀，48 h 内继发全身性关节炎，有前肢、侧肢肿胀表现，耳部、尾部有炎性结节表现。

(3)药物处理:阳性药物对照组大鼠建模次日给予甲氨蝶呤灌胃，以成人用量经表面积转化为大鼠等效剂量，将甲氨蝶呤溶于生理盐水，配置为浓度为0.051 mg/ml 的溶液，按照1 ml/100 mg 用量灌胃。 参照文献[5]中相关剂量，分别给予TSC 低、中、高剂量组50、100、200 mg/kg/d TSC 灌胃。 空白对照组及RA 模型组均给予等体积生理盐水灌胃。灌胃处理15 d 后进行指标检测。

1.4.2 血清炎症因子检测 采用10%水合氯醛麻醉大鼠，采集腹主动脉血，3 000 r/min 离心15 min，分离血清，置于-80℃冰箱待用。 采用酶联免疫吸附测定法检测大鼠IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平，按照试剂盒相关规定进行操作。

1.4.3 大鼠踝关节周长及左后足厚度测量 分别于建模前后及给药前后，用游标卡尺测量大鼠左后足关节厚度及踝关节周长，计算踝关节肿胀度。 根据关节肿胀度划分关节炎指数，肿胀度＜5% 计0 分、5% ~15%计1 分、16% ~30%计2 分、31% ~60%计3 分、肿胀度＞60%计4 分。

肿胀度＝建模后(给药后)踝关节厚度-建模前(给药前)踝关节周长

1.4.4 大鼠踝关节病理组织观察 取麻醉后大鼠将其处死，手术者离断大鼠注射侧踝关节，固定于4%多聚甲醛，脱钙、脱水处理，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下摄片，观察其踝关节病理改变。按照滑膜炎(滑膜衬层细胞成数、血管翳、炎细胞浸润、新生血管)、骨/软骨破坏(骨侵蚀、软骨侵蚀、关节粘连、关节结构破坏)、关节修复(新生骨、关节软骨)等3 个方面行病理组织学评分(病理学积分)，按照各项的严重程度，分别得0 ~3 分，正常为0 分、轻度为1 分、中度为2 分、重度为3 分，总得分0 ~40 分，得分越高提示大鼠踝关节病理改变越严重。所有操作及病理结果均由同一位操作者进行，减少因个体差异所导致的误差。

1.4.5 Western blot 检验 10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉后处死大鼠，取大鼠注射侧踝关节滑膜组织，加入RIPA 细胞裂解液1 ml，4℃、1 200 r/min离心15 min，收集含有组织总蛋白的上清液，BCA法检测蛋白质浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳，浓缩胶80 V、30 min，分离胶120 V、1 h，300 mA 恒流转膜，PBST 漂洗5 min，5%脱脂奶粉摇床室温封闭2 h，依照说明书，采用封闭液配置一抗，浓度:TBST 一抗2 000 ∶1，4℃孵育12 h，加入二抗，抗TLR4 1∶200，抗MyD88 1 ∶200，抗NF-κB p65 1 ∶200，抗NF-κB p65 磷 酸 化(phosphorylation of NF-κB p65，p-NF-κB p65)1 ∶200，抗β-actin 1 ∶1 000，抗GAPDH 1∶1 000， 室 温 下 孵 育2 h， PBST 洗 涤10 min、3 次，应用ECL 超敏发光试剂盒进行化学发光与X 胶片显影，定影，凝胶图像处理系统分析灰度条带图片，定量分析各组TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白表达量及p-NF-κB p65 蛋白水平。

1.4.6 实时荧光定量PCR 取大鼠踝关节滑膜组织，剪碎，滴加Trizol 溶液，提取组织总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH 为内参，采用2-△△Ct计算TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 表达量。 逆转录条件为37℃，反应15 min，逆转录酶失活条件为85℃，反应15 s。 在95℃下激活DNA 聚合酶5 min进行PCR，循环40 次，反应条件为95℃、10 s，60℃、30 s 最终延伸75℃下反应10 min，最后温度维持在4℃。 引物序列如下，actin 上游引物:5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′， 下 游 引 物: 5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′； NF-κB 上 游 引 物: 5′-GGCATGCGTTTCCGTTACAA-3′，下 游 引 物:5′-ATTGGGTGCGTCTTAGTGGT-3′；MyD88 上游引物:5′-CGGAGGCATCCAACAAACTGC-3′，下 游 引 物:5′-GAGGACAATGCTCTGGGGAG-3′；TLR 上 游引 物:5′-GAGGACAATGCTCTGGGGAG-3′， 下 游 引 物: 5′-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGT-3′。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计学软件对数据进行处理。 计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t 检验。 以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠踝关节周长、足垫厚度及关节炎指数比较 RA 模型组大鼠踝关节周长、足垫厚度以及关节炎指数水平均高于空白对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC 低、中、高剂量组大鼠踝关节周长、足垫厚度以及关节炎指数水平均低于RA 模型组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC 低、中剂量组大鼠踝关节周长、足垫厚度以及关节炎指数水平相似，均高于TSC 高剂量组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠踝关节组织病理改变程度比较 RA模型组大鼠病理学积分高于空白对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC 低、中、高剂量组大鼠病理学积分均低于RA 模型组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC 低、中剂量组大鼠病理学积分相似，均高于TSC高剂量组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 见表2。

表1 各组大鼠踝关节周长、足垫厚度及关节炎指数比较(¯x±s)

表2 各组大鼠踝关节组织病理改变程度比较(¯x±s，积分/分)

2.3 各组大鼠血清炎症因子水平比较 RA 模型组大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平均高于空白对照组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC 低、中、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平均低于RA 模型组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC低、中剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平相似，均高于TSC 高剂量组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 见表3。

表3 各组大鼠血清炎症因子水平比较(¯x±s)

2.4 各组大鼠Toll 样受体信号通路蛋白表达比较 RA模型组MyD88、NF-κB p65、TLR4 蛋白及p-NF-κB p65 蛋白水平均高于空白对照组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC低、中、高剂量组MyD88、NF-κB p65、TLR4 蛋白及p-NF-κB p65 蛋白水平均低于RA 模型组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC低、中剂量组MyD88、NF-κB p65、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白水平相似，均高于TSC 高剂量组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。 见表4。

表4 各组大鼠Toll 样受体信号通路蛋白表达及踝关节组织p-NF-κB p65 蛋白水平比较(¯x±s)

2.5 各组大鼠Toll 样受体信号通路中各信号分子基因表达情况比较 RA 模型组大鼠踝关节组织内MyD88、NF-κB p65 及TLR4 的mRNA 相对表达量均高于空白对照组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC 低、中、高剂量组大鼠踝关节组织内MyD88、NF-κB p65 及TLR4 的mRNA 相对表达量均低于RA 模型组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。 阳性药物对照组及TSC 低、中剂量组大鼠血清踝关节组织内MyD88、NF-κB p65 及TLR4 的mRNA 相对表达量相似，均高于TSC 高剂量组，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。见表5。

表5 各组大鼠Toll 样受体信号通路中各信号分子基因表达情况比较(mRNA 相对表达量，¯x±s)

3 讨论

威灵仙是我国传统祛风湿性药物，临床研究表明，威灵仙熏洗能有效缓解关节炎患者的关节疼痛与肿胀症状，改善其关节功能[10]。 TSC 提取自威灵仙，是威灵仙的有效成分，被证实有良好的抗炎止痛功效。 本研究利用弗氏完全佐剂法制备RA 大鼠模型，并分别向RA 模型大鼠行50、100、200 mg/kg/d的TSC 灌胃处理，结果显示，经不同浓度TSC 灌胃处理后的RA 大鼠踝关节周长、足垫厚度及踝关节炎症指数水平均更低；病理组织观察发现，TSC 处理后的RA 模型大鼠踝关节病理改变更轻，且呈剂量依耐性减轻。 这说明TSC 可有效改善RA 模型大鼠关节肿胀及RA 病理改变。

炎症反应是RA 致病机制中的重要组成部分。有研究报道，IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量与RA 病情严重程度之间存在密切联系，炎症反应是导致RA持续存在、病情迁延的重要原因[11-12]。 本研究中，RA 模型组大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 较空白对照组大鼠明显升高，说明RA 大鼠体内存在严重的炎症反应，机体抗炎机能降低。 而经不同浓度TSC灌胃处理后的RA 大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α水平均较RA 模型组下降，提示TSC 可降低RA 大鼠机体炎症反应强度。

TLR 是RA 研究中重要的模式识别受体，其信号通路与多种自身免疫性疾病相关。 TLR 结合内源性配体，通过其损伤分子模式识别后，由细胞表面MyD88 介导下游NF-κB 向核内传递信号，进而诱导炎症因子IL-6、TNF-α 等细胞因子表达，TLR4还可以通过激活MyD88/NF-κB 通路诱导激活蛋白-1 产生免疫炎症反应， 参与RA 的发生与发展[13-15]。

为探讨TSC 是否通过TLR 信号通路抑制炎症反应，减轻RA 病理改变，本研究行Western blot 检验发现，经不同浓度TSC 处理后的大鼠踝关节滑膜组织内MyD88、NF-κB p65 及TLR4 蛋白表达量均较RA 模型组降低，p-NF-κB p65 蛋白水平也较RA模型组降低。 NF-κB 是细胞内较常见的核转录因子，参与炎症反应调节，NF-κB p65 可活化NF-κB进入细胞核调节基因转录，激活与早期炎症及应激反应相关的基因，产生IL-6、TNF-α 等大量炎症因子，参与RA 的发生及进展。 此外，本研究结果还发现，实时荧光定量PCR 检测TLR 信号通路中各信号分析基因表达量结果与Western blot 结果一致，且随着TSC 浓度的增加，RA 小鼠踝关节滑膜组织内MyD88、NF-κB p65、TLR4 蛋白及基因表达量均呈剂量依耐性降低。 这说明TSC 可能通过调控TLR 信号通路，发挥抗RA 功效。 但受限于研究设计与研究条件，本研究并未对TSC 治疗RA 的其他可能途径进行研究，存在一定的不足。

综上所述，TSC 可能通过抑制TLR 信号通路(TLR4/MyD88/NF-κB p65)，降低机体炎症反应，减轻RA 大鼠踝关节病理改变及关节肿胀度。