沉默NOX4对百草枯诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化应激和凋亡的影响

李 咏，程 静，卢 立，贺文娟，刘 立，宋红萍，吴 涛

0 引言

百草枯(Paraquat，PQ)是一种高效能的农作物除草剂，对人畜具有很强的毒性，其诱导的实验性肺纤维化模型广泛用于肺纤维化发生机制和治疗策略研究[1]。既往研究显示，还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)与肺纤维化关系密切。NOX4可能通过促进ROS的大量产生，引起氧化应激损伤，参与肺纤维化的发生发展[2]。本研究旨在探讨NOX4在百草枯诱导人Ⅱ型肺泡上皮样A549细胞氧化应激和凋亡中的作用，揭示百草枯诱导肺纤维化的机制，也为肺纤维化治疗提供新的可能靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料和试剂 人肺泡Ⅱ型上皮样细胞A549来自中国科学院上海细胞库；百草枯(Paraquat)购自美国Sigma-Aldrich公司；胰酶、PBS购自北京Solarbio科技有限公司；F12K完全培养基、胎牛血清、Opti-MEM购自美国Gibco公司；Trizol、Lipofectamine®RNAiMAX购自美国Invitrogen公司；Real-time PCR试剂盒购于大连TaKaRa公司；PCR引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成；细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)购自北京Solarbio科技有限公司；细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；β-actin(no.4967)一抗购自美国CST公司；丙二醛(MDA)ELISA检测试剂盒(HM10250)、NOX4(PAB30655)一抗购自武汉Bioswamp生物科技有限公司；ECL化学发光试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 主要仪器 CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；SW-CJ-1D洁净工作台(苏州智净净化设备有限公司)；ROS-S15实验室超纯水机(武汉吉百瑞公司)；Icen-24R高速冷冻离心机(杭州奥盛公司)；凝胶成像仪(ChemiDoc XRS，Bio-Rad公司)；CFX-Connect 96荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)；DYCZ-24DN电泳仪(北京六一电子仪器公司)；ACEA NovoCyte流式细胞仪(美国艾森生物公司)。

1.1.3 细胞培养与试剂配制 人肺泡Ⅱ型上皮样细胞A549培养于含有10%胎牛血清的F12K培养基，培养于37 ℃、含5%CO2的饱和湿度细胞培养箱，常规消化传代，选取对数生长期细胞进行试验。百草枯用生理盐水溶解配制。

1.2 NOX4-siRNA设计与筛选

1.2.1 NOX4-siRNA的设计合成 针对NOX4的siRNA和阴性对照siRNA(siN0000001-1-5)由广州锐博生物科技有限公司设计合成，序列见表1。采用Blast查询验证，排除与其他基因同源。

表1 NOX4小干扰RNA序列

1.2.2 NOX4-siRNA的筛选 取对数生长期的A549细胞，消化、离心，收集细胞。用含有血清的完全培养基重悬细胞，以5×105的细胞密度接种于6孔板中。待细胞生长至90%融合时进行转染。细胞分为空白对照组(未转染)、3个实验组(转染NOX4-siRNA-1组、转染NOX4-siRNA-2组、转染NOX4-siRNA-3组)，阴性对照组(转染siRNA-NC)组。每个转染样品按如下方法操作：取100 pmol siRNA稀释于250 μl Opti-MEM，另取5 μl Lipofectamine®RNAiMAX稀释于250 μl Opti-MEM，室温下静置5 min，再将2种溶液混匀，室温孵育20 min，使形成siRNA-脂质体复合物溶液。将500 μl复合物溶液加入到细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，转染4 h后更换新鲜培养基培养。转染48 h后，收集细胞，采用RT-PCR和Western blot方法检测NOX4表达情况，筛选出最佳干扰质粒，进行后续实验。

RT-PCR检测NOX4 mRNA的表达：细胞转染48 h后收集细胞，按Trizol试剂说明书提取细胞总RNA；采用特异性下游引物法将其反转录成cDNA，之后，以GAPDH为内参，RT-PCR检测干扰效率，反应条件为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、56 ℃退火10 s及72 ℃延伸25 s，进行40个循环，每个样品设置3个复孔，在CFX-Connect 96荧光定量PCR仪上进行，实验重复3次。NOX4引物序列：上游为5′-CAACTGAAACCAAAGCAAC-3′，下游为5′-CAAACCAACGGAAGGAC-3′。GAPDH序列：上游为5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游为5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′。

Western blot检测细胞NOX4蛋白表达：细胞转染48 h后，收集细胞；吸去培养液，以适量预冷的PBS洗涤细胞2次；吸去PBS，按照每1×106个细胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液200 μl，4 ℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5 ml EP管中，95 ℃以上加热10 min，12 000 g离心10 min，取上清，进行蛋白质定量。各组取等量细胞总蛋白(20 μg)于SDS-PAGE电泳分离蛋白，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h；与抗NOX4一抗稀释液(1∶1 000)和抗GAPDH一抗稀释液(1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜，洗膜；加入HRP标记二抗稀释液(1∶10 000)室温孵育1 h，洗膜；ECL化学发光显色，将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。依据不同质粒转染后的NOX4蛋白表达量，筛选出最佳干扰质粒，进行后续实验。

1.3 实验分组及细胞转染 后续实验将A549细胞随机分为：①对照组(细胞正常培养，不做任何处理)；②PQ组(细胞以700 μM PQ处理24 h)；③PQ+NOX4-siRNA组(细胞转染NOX4-siRNA 48 h后，再以700 μM PQ处理24 h)；④NOX4-siRNA组(细胞仅转染NOX4 siRNA)。细胞转染前24 h，在2 ml完全培养基中接种5×105个细胞，种于6孔板，转染时细胞融合度为90%。转染操作如“1.5”所述。将细胞板置于37 ℃、5%CO2培养箱中，转染完成后加入PQ(700 μM)继续培养24 h。

1.4 CCK-8检测 A549细胞以PQ处理24 h，取出细胞培养板，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h。在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔和对照孔，每组设定3个复孔。

1.5 ELISA检测 A549细胞以PQ处理24 h，以PBS冲洗细胞，-80 ℃反复冻融使细胞破坏并释放出细胞内成分。按照试剂盒说明书操作检测MDA含量。实验重复3次。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 A549细胞以PQ处理24 h，常规胰酶消化各组细胞，收集细胞；PBS轻洗细胞1次；加入195 μl Binding Buffer重悬细胞；细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC试剂，混匀后4 ℃避光孵育20 min；400 g离心5 min，小心弃上清液；加入190 μl Binding Buffer重悬细胞；细胞悬液中加入10 μl PI轻轻混匀，4 ℃避光孵育5 min，1 h内送检分析，实验重复3次。

1.7 流式细胞仪检测细胞ROS水平 A549细胞以PQ处理24 h，常规胰酶消化各组细胞；按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM；细胞收集后悬浮于1 ml稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×106/ml，置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱内孵育20 min；每隔3 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触；用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；收集各组细胞，500 μl PBS重悬，1×106/ml，上流式细胞仪检测ROS；使用 NovoCyte 分析软件进行分析。

1.8 Western blot检测 A549细胞以PQ处理24 h，收集细胞，进行Western blot检测，操作同“1.5”。目标蛋白NOX4一抗稀释比例为1∶1 000，内参β-actin稀释比例为1∶1 000，HRP标记二抗稀释比例为1∶20 000。以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 筛选最佳干扰siRNA 采用RT-PCR法和Western blot方法从3对siRNA中筛选出最佳RNA干扰序列(图1)。结果显示，转染NOX4-siRNA-1组干扰效率最高且NOX4蛋白表达水平最低。因此，选定NOX4-siRNA-1对应的序列进行后续细胞实验。

图1 NOX4 siRNA的筛选注：A.RT-PCR结果；B.Western blot结果。**与对照组比较，P<0.01

2.2 siRNA对PQ诱导A549细胞NOX4表达的影响 采用Western blot方法检测NOX4蛋白表达，结果表明，PQ诱导NOX4表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与PQ组相比，转染NOX4 siRNA能够明显减少NOX4的表达，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 沉默NOX4抑制PQ诱导的A549细胞NOX4表达注：与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与PQ组比较，##P<0.01

2.3 siRNA对PQ诱导A549细胞活力和MDA的影响 PQ(700 μM)诱导A549细胞24 h后，细胞活力受到明显抑制(P<0.01)；PQ+NOX4 siRNA组细胞的活力升高，与PQ组相比，差异具有统计学意义(P<0.01，图3A)。PQ(700 μM)作用于A549细胞24 h诱导MDA含量明显增加(P<0.01)；与PQ组相比，siRNA能够明显减少A549细胞MDA产生(P<0.01)，见图3B。

图3 沉默NOX4减轻PQ诱导的A549细胞毒性及MDA生成注：A.细胞活力(%)；B.MDA含量(nmol/L)。与对照组比较，**P<0.01；与PQ组比较，##P<0.01

2.4 siRNA对PQ诱导A549细胞凋亡的影响 PQ(700 μM)作用于A549细胞24 h后，各组细胞凋亡率比较差异均有统计学意义。其中PQ组凋亡率高于对照组(P<0.01)；与PQ组相比，siRNA可降低A549细胞凋亡率(P<0.01)，见图4。

图4 沉默NOX4减轻PQ诱导的A549细胞凋亡率注：A.对照组；B.PQ组；C.PQ+NOX4 siRNA组；D.NOX4 siRNA组。**与对照组比较，P<0.01；##与PQ组比较，P<0.01

2.5 siRNA对PQ诱导A549细胞氧化应激(ROS)的影响 采用流式细胞术检测A549细胞ROS水平，结果表明，PQ诱导A549细胞ROS水平显著升高(P<0.01)；与PQ组相比，转染NOX4 siRNA能够明显降低ROS水平(P<0.01)，如图5。

图5 沉默NOX4减少PQ诱导的A549细胞活性氧注：A.对照组；B.PQ组；C.PQ+NOX4 siRNA组；D.NOX4 siRNA组。**与对照组比较，P<0.01;##与PQ组比较，P<0.01

3 讨论

肺纤维化是以肺间质弥漫性渗出、浸润和纤维化为主要病变的疾病，至今缺乏有效的治疗手段。体内外模型是研究肺纤维化发病机制的有力工具。研究者采用了多种方法建立肺纤维化模型，包括石棉微粒诱导、博来霉素诱导、平阳霉素诱导和百草枯诱导等；其中，百草枯的靶器官为肺脏，使用百草枯诱导动物肺纤维化常选用小鼠、大鼠、家兔等，采用一次性口服灌注和腹腔注射的给药方式[3]。百草枯为联吡啶类化合物，化学名为1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶鎓盐，是一种速效除草剂，具有类似多胺的结构，易被肺泡I型上皮细胞和肺泡II型上皮细胞主动摄取，因此百草枯在肺内高度浓集，使得肺脏成为主要的毒性靶器官，最终形成纤维化[4]。

目前认为百草枯导致肺纤维化的机制主要包括DNA损伤、氧化损伤、肺泡损伤、细胞因子网络等[5]。百草枯中毒造成的肺损伤主要与活性氧、过度脂质过氧化反应所产生的脂质过氧化氢物及谷胱甘肽含量减少有关。研究发现，多个活性氧(Reactive oxygen species，ROS)相关途径的信号分子水平增加，例如NOX上调、血管紧张素Ⅱ激活、活性氧调节剂水平上升等，可以促进ROS的生成，参与纤维化的发生发展[6]。NOX家族是细胞ROS的主要来源，由以下几种同工酶组成：NOX1-NOX5和双重氧化酶。最新研究显示，NOX4在多种因素诱导的肺纤维化中均发挥重要作用。NOX4在特发性肺纤维化患者和肺纤维化小鼠模型的肺泡Ⅱ型细胞上均呈现高表达，生成过量ROS，使细胞DNA、蛋白质和脂质发生严重氧化损伤，并且进一步激活p53，诱导AECs凋亡[7]。本实验结果显示，PQ诱导A549细胞NOX4高表达，伴随着A549细胞凋亡率明显增加，而采用siRNA沉默NOX4表达则明显抑制了PQ诱导的A549细胞凋亡，显示NOX4在PQ诱导A549细胞凋亡中发挥关键作用，NOX4有可能成为肺纤维化的治疗靶点。

近年还发现内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)启动的凋亡途径是一种新的凋亡途径[8]。内质网应激是细胞对内质网蛋白累积的一种适应性应答方式，但内质网应激过强或持续时间过长，超过细胞自身的调节能力，则能够通过激活下游促凋亡信号分子，如CHOP、caspase-12等来诱导细胞凋亡[9]。氧化应激状态能够诱发内质网相关功能失调，生成大量未折叠蛋白质，通过激活复杂的细胞质和细胞核信号通路诱导ERS。Xu等[10]研究发现，PQ在体外能够诱导A549细胞凋亡信号分子Bax、GRP78和CHOP表达上调，这一效应可被抗氧化剂所拮抗，显示PQ通过诱导氧化应激损伤启动AEC内质网应激和凋亡。本实验结果表明，采用siRNA沉默NOX4表达能够明显抑制PQ诱导的A549细胞ROS产生，推测NOX4介导了PQ诱导A549细胞氧化应激和凋亡的效应。

综上，本研究采用脂质体介导siRNA转染的方式，利用PQ诱导体外肺纤维化模型探究NOX4在肺纤维化中的作用与机制，为肺纤维化提供了新的可能治疗靶点。今后拟使用NOX4稳定低表达的慢病毒载体和基因敲除动物继续开展研究。