常温机械灌注体外修复心脏死亡供肾的初步探索

何宇，余双进，阮和欢，李昉聪，陈海威，黄炀，吴国彬，张逸民，戚芳泽，陈洁，钱行，刘彦含，杨雨滢，陈彤，张涛，陈宏珲，陈传宝，赵强，郭志勇，陈国栋，邱江，何晓顺（.中山大学附属第一医院器官移植中心，广东 广州，50080；.中山大学中山医学院，广东 广州 50080）

在世界范围内，标准的供体肾脏保存方法是静态冷藏。由于供肾来源的减少以及肾脏疾病终末期人群的逐年增加，人们越来越多的使用质量不佳的供肾［1-2］。这些供肾主要来源于扩大 标 准 供 体（extended criteria donors， ECD） 以及心脏死亡捐献供体（donors after cardiac death，DCD）［3-4］，其对缺血的耐受性低下，常规的静态冷保存导致的缺血/再灌注损伤进一步增加了移植后原发性无功能（primary nonfunction， PNF）和移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）等并发症的发生率，降低了移植肾的存活率［5-6］。因此急需优化的策略来保存、改善甚至逆转受损的供肾。最近，常温机械灌注（normothermic mechine perfusion，NMP）越来越引起大家的重视［7-9］，相比经典冷保存以及低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）［10-11］，NMP 有其独特的优势：NMP 能在体外为器官提供接近生理条件的常温、有氧血流供应，维持接近正常的代谢状态，使其既能评估器官活力，亦可减轻或避免冷缺血损伤，甚至修复器官损伤［12-14］。目前有许多移植中心已经发现了常温机械灌注的潜力并开展了相应的探索研究，目前该技术还在探索阶段，最佳的灌注策略尚无明确共识，相关研究报道较少。因此我们中心进行了9 例的猪肾常温机械灌注以及1 例的猪肝肾联合常温机械灌注，本文将分享我们中心在肾脏常温机械灌注中的经验，旨在进一步优化NMP 灌注方案，并为进一步的常温机械灌注相关研究的设计与实施提供指导思路与理论依据。

1 资料与方法

1.1 肾脏和血液的获取：猪肾和血液的收集来自当地屠宰场（广州禺山肉类食品有限公司）。按照正常的屠宰场程序放血。采集自体血加入500 ml乳酸钠林格溶液以及3 支肝素钠注射液（2 ml：1.25 万U）抗凝。猪死亡后迅速取出全腹脏器进行冷保存，因屠宰程序导致器官获取期间无可避免地经历约20 min 热缺血损伤。随后在4℃环境下打开腹主动脉后壁，找到左肾动脉分支处和右肾动脉分支，插入准备好的动脉插管进行冷灌注，这标志着冷缺血（cold ischemic，CI）的开始。冷灌注液为乳酸钠林格溶液（每1000 ml 乳酸钠林格溶液加入1 支肝素）或者高渗枸橼酸盐嘌呤溶液（每500 ml高渗枸橼酸盐嘌呤溶液加入半支肝素）。单肾和肝肾联合在获取上的区别主要是：肝肾联合在动脉灌注前需要先经肠系膜上静脉进行冷灌注，在冷灌注准备完成并分离肝肾组织保留右肾和肝后，需要对胆道及输尿管进行插管并固定。

1.2 体外NMP：我们中心采用体外机械灌注系统（Organ Assist， Groningen， The Netherlands）对离体肾脏进行NMP。具体操作细节可参考本中心过往的研究［15-16］。NMP 灌注液成分：猪自体全血500 ml，乳酸钠林格溶液500 ml，3 支肝素，羟乙基淀粉500 ml，甲硝唑注射液100 ml，复方氨基酸注射液100 ml，甘露醇100 ml，葡萄糖酸钙注射液10 ml，甲强龙40 mg，头孢哌酮舒巴坦2 g。开始灌注前将灌注液加入灌注管路，排除管路中气泡，调节恒温水浴箱水温为38 ℃，开启灌注机灌注模式，待循环充分后检测灌注液的电解质、酸碱水平并将之调整至生理范围。随后将冷保存的肾脏转移至灌注器官盆，迅速将动脉插管置入肾动脉并固定，将灌注压力调整至70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），开始常温机械灌注。灌注过程中，根据NMP 灌注液生化电解质水平变化补以适量的氯化钙溶液、氯化钾溶液；根据NMP 灌注液中的葡萄糖浓度和酸碱度补以适量的5%葡萄糖溶液和碳酸氢钠溶液；给予等量的乳酸钠林格溶液-灭菌水混合液补充每小时丢失尿量，乳酸钠林格液-灭菌水混合液的比例根据尿量及灌注液的电解质水平进行调整。

1.3 灌注时长以及观察指标：我们统一选取灌注9 h 作为灌注终点，分析9 h 的灌注数据；若在灌注过程中发现灌注情况良好，则会延长灌注时间直至无尿，但在统一分析时仍分析灌注9 h 内的数据。根据制定的试验方案对灌注的压力、流速、尿量以及每小时灌注液和1、3、6、9 h 尿液的血气生化数据进行了记录分析。留取了肾外观以及尿液外观照片，并在实验零点和终点对肾脏穿刺并行HE 病理染色分析。灌注过程中，外观上观察肾脏的颜色质地变化以及尿液的颜色变化；纳入分析的主要灌注参数包括：肾动脉流速、肾动脉灌注压、每小时尿量以及灌注时长、氧分压（oxygen partial pressure，PaO2）、二氧化碳分压（partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、PH 值、乳 酸（lactate，LAC）、葡萄糖水平以及钠、钾、钙等离子浓度。病理穿刺标本则采取HE 染色观察肾小球及肾小管急性炎症与损伤程度。

1.4 生理生化指标［14-15］：表1 为猪的生理生化指标。

表1 猪的生理生化指标

2 结 果

共进行了10 例肾脏灌注，对10 例肾脏灌注按实验开展顺序予以1 ～10 编号，其中4 号肾脏为肝肾联合灌注。对灌注情况进行描述性分析。

2.1 尿量变化（图1）：每小时分段收集尿液进行分析。所有的肾脏均产生尿液，外观从透明到淡红不等。其中6 号猪肾灌注全程无明显肉眼血尿。6 号猪肾灌注时长最长，第14 小时的每小时尿量为30 ml。大多数肾脏灌注尿量在3 h 左右达到峰值，随后逐渐降低。本中心在临床上开展的3 例无缺血肾移植的体外NMP 结果也显示灌注第3 小时尿量有所下降。各组之间尿量差异较大。8 号猪肾灌注3 h 后出现异常高值且无规律，且尿液颜色为深红血色，考虑可能存在穿刺导致血管-小管瘘。肝肾联合灌注组尿量较单肾灌注组尿量少，考虑可能是肝脏容量大导致灌注液总量相对偏少，循环灌注不足所致。

图1 肾脏灌注期间每小时尿量（ml）

2.2 肾脏灌注前、后的外观（图2）：10 例肾脏体外常温机械灌注中，6 号肾脏灌注时长最长为16 h，该例肾脏灌注全程无明显肉眼血尿。6 号肾脏猪肾灌注情况良好，上机5 min 后可见猪肾表面均匀红色充盈，肾脏表面富有张力。6 h 后肾外观颜色变暗，呈暗紫色，结合血气分析指标以及尿液分析指标考虑肾的保钠排钾排酸功能下降，肾功能开始下降。同时发现灌注液颜色也变暗，因此不排除灌注液颜色变化导致的肾外观变化。16 h 下机后的肾脏剖面显示肾盂肾盏出血明显，肾皮髓质有轻微血色，考虑出血；肾皮髓质质感软绵疏松，结合病理考虑肾损伤情况较为明显。选取9 号猪肾代表灌注时长为9 h的肾外观情况，可以看见肾脏灌注9 h 后普遍出现肾盂肾盏出血现象，肾皮髓质出血点较为明显，质地明显变差。而肝肾联合灌注9 h 后肾脏剖面显示肾盂肾盏出血不明显，肾皮髓质无血色，质地较为正常。

图2 肾脏灌注外观及灌注终点剖面观

2.3 肾动脉压力和流速（图3）：肾动脉压力通过改变泵速来调节，灌注过程的动脉压保持在65 ～70 mmHg。正常灌注流速在灌注初始阶段逐渐升高，并在第2 小时达到峰值，随后保持稳定水平。这与本中心发表的一篇关于人弃肾长时间体外常温机械灌注经验探索的文章的结果相符合。多数猪肾灌注流速稳定后的平均水平为100 ml/min 左右。2 号猪肾流速稳定后维持在150 ml/min 左右。肝肾联合灌注流速迅速升高，第30 分钟到达顶峰190 ml/min 左右，第2 小时开始逐渐下降，考虑可能因肝脏容量较大，间接导致循环容量不足进而使肾脏灌溉不足有关。

图3 肾脏NMP 期间流速

2.4 灌注液血气变化（图4）：在NMP 过程中，PaO2基本稳定维持在350 ～ 450 mmHg；而PaCO2各组间差别较大，且部分肾脏灌注期间PaCO2的波动范围也较大。在实验过程中我们发现PaO2和PaCO2的变化主要受制氧机的供氧流量与浓度的影响，后续实验发现根据pH 值变化相应地调节制氧机供氧流量就可以将pH 值控制在相对生理范围。灌注液pH 在灌注初始阶段大都持续上升，部分猪肾灌注液pH 则在灌注早期出现pH 下降，并均在第2 小时后逐渐趋于稳定而随着实验的方案的改进，现在已经可以将肾脏pH 控制在正常生理范围。肝肾联合组pH 基本波动在正常范围。根据PaCO2以及碱剩余可以发现多数灌注肾脏呈代谢性或呼吸性碱中毒；而肝肾联合、2 号猪肾出现代谢性酸中毒。

图4 灌注液氧分压、二氧化碳分压与酸碱水平

我们对灌注液中Na+/K+/Ca2+离子水平进行了动态检测。多数猪肾灌注Na+逐渐升高，3 ～ 4 h开始逐渐下降，随后达到稳定水平，稳定期基本上接近正常值范围；肝肾联合组的Na+波动较小，稳定后浓度位于正常范围。灌注半小时内Ca2+于1.5 下降至1，随后开始升高，后稳定维持在1.5 ～2 mmol/L。基线K+浓度偏低，通过人为干预基本可维持在正常水平。少数偏离值出现均是因为额外补钾所致（图5）。

图5 灌注液电解质水平

灌注过程中血糖逐渐升高，灌注2 h 后达到峰值，随后逐渐下降，提示常温灌注过程中持续有能量消耗。2 号猪肾、3 号猪肾血糖偏离值产生的原因是临时补充葡萄糖。肝肾联合组的血糖较单肾灌注组的高，可能原因是1 h 时补了葡萄糖酸钙。单肾灌注的乳酸水平呈升高趋势，肝肾联合的乳酸水平逐渐降低（图6）。

图6 乳酸与葡萄糖水平

2.5 病理变化（图7）：对灌注零点、灌注1 h、灌注3 h、灌注6 h、灌注终点的肾穿刺组织标本进行HE 病理染色。由于肾脏为受过严重热缺血损伤的AKI 肾脏，肾脏零点病理普遍存在肾小管上皮细胞肿胀，肾小球体积稍增大；肾脏灌注终点病理普遍存在轻度肾小球炎以及急性轻-中度肾小管损伤改变。染色病理结果显示小球及小管的损伤在灌注过程中缓慢加重，这提示常温机械灌注可能延缓了小球及小管损伤的进展。有趣的是，9 号肾脏的病理结果显示肾小管上皮刷状缘脱落的程度逐渐减轻，这提示NMP 可能对AKI 肾脏存在一定的修复作用。

图7 肾脏穿刺组织切片HE 染色（HE×200）

3 灌注过程遇到的问题以及解决方法

由于NMP 肾脏灌注还处于探索阶段，具体的方案流程还需要逐步完善，现在将实验中遇到的问题以及解决办法进行汇报。第1 例肾脏灌注预试验人员操作不熟练，没有尿液生成。因此我们建立了标准化的灌注流程，减少人为操作带来的误差；调整血气基线水平，使基线值维持在生理范围。在灌注过程这个，我们还遇到pH 持续偏碱无法调节的情况。通过调节制氧机流量，使pH维持在生理范围。若冷灌注过程中发现肾脏冷灌注情况不佳，结合肾脏外观考虑肾可能出现微血栓时，可以通过提高肾修整速度，减少热缺血时间；若肾脏血管情况复杂可直接从主动脉灌入冷灌注液，从而减少热缺血时间。在灌注过程中若发现肾动脉流速持续偏低，且肾外观疑似血栓，可以注入尿激酶溶栓处理。

4 讨 论

常温机械灌注技术已经较为成熟，但是在肾脏方面的应用还比较少，临床上的肾移植术前供肾保存方法基本上还是传统的冷保存，在临床肾移植中NMP 的应用鲜有报道，缺乏多中心的随机对照试验［16-18］。NMP 在肾移植领域应用远远落后于肝移植的原因可能是因为传统的冷保存技术非常成熟便捷，且从长远预后来看，NMP 比起冷保存并无明显优势［8，13，19-20］。但有研究证实NMP 可以在边缘供肾的修复和保存发挥作用［1，21-23］，这提示NMP 有望扩大供肾来源，提高终末期肾病患者的肾移植率以获得更好的预后和生活质量。而且NMP 灌注肾脏非常有研究前景，在稳定模拟人体正常肾脏生理活动的情况下，NMP 肾脏灌注可以成为器官体外干预、器官体外评估或体外药物试验平台。然而肾脏NMP 目前仍处于早期摸索阶段，为此需要尽可能延长NMP体外灌注肾脏时长，这也是本研究的主要目的之一。

整体灌注质量分析。根据10 例的肾脏灌注，初步得到以下经验小结。肾脏观测指标的基线水平对肾脏灌注的影响较大。因此在灌注前需要将肾脏各项观测指标的水平调整至正常的生理范围。本研究结果显示，大多数肾脏灌注时长可以稳定在9 h 左右；灌注液的血气水平可以通过人为干预维持在相对正常水平。肝肾联合组灌注液比起其他组显示出更为正常且稳定的生化指标，但是尿量较少，可能需要增加灌注液的容积，并监测肾小球动脉压以确保肾脏能拥有足够的灌注。随着灌注方案的完善以及实验人员操作熟练程度的提高，目前灌注可以通过以下两个方面的处理使血气生化维持在相对正常生理范围：根据尿量补充等尿量的林格-灭菌水混合液以维持灌注系统容量电解质平衡。通过调节制氧机氧气管夹调节氧流量，从而使pH 稳定在相对正常范围。通过人工调节灌注液血气生化以及电解质可以使灌注液维持在一个正常的生理浓度，但同时也导致无法单纯通过灌注液的生化水平直接反应肾脏代谢功能，这需要结合尿液的血气电解质水平来综合判断肾脏功能。同时，若想探究影响肾脏灌注的具体因素，可能需要通过更多的灌注例数来寻找相关因素。

评估肾脏情况除了观察灌注流速、尿量、肾外观、尿液性状外，还应根据灌注液和尿液的血气结果综合分析。我们尝试了1 例肝肾联合灌注，发现在同样的实验方案以及实验人员下，肝肾联合灌注过程中的生化指标更正常且稳定，肝肾联合LAC 水平逐渐降低，符合肝脏对乳酸的代谢作用，而单肾灌注中LAC 水平不断升高。但我们发现肝肾联合的灌注时长以及尿量对比单肾灌注并没有明显优势，提示乳酸可能对肾脏没有明显影响；此外，灌注液中的乳酸水平比尿液中的略高，提示肾脏能够排泄部分乳酸。观察灌注中流速的变化趋势可以得知一般灌注流速均逐渐升高，在第2 小时到达顶峰，随后稳定在100 ml/min 水平。同时我们还发现，虽然流速可以在灌注前期反映肾脏的灌注情况，但是在后期流速会逐渐升高且稳定在一个水平，通过肾脏剖面与病理分析提示其并不能反映肾脏即时的灌注情况。我们发现，多数灌注肾脏尿量在3 h 左右到达顶峰，随后逐渐降低，结合灌注液以及尿液中的血气生化电解质水平，考虑肾脏的排泄功能在灌注3 h 后开始下降。这也提示无尿作为单一研究终点可能存在不合理性，对我们后期灌注的研究终点选定提供了依据。现阶段的实验为探索性实验，常温机械灌注为心死亡离体肾脏提供接近生理状态的环境，与生理状态还存在一定差异。在灌注过程中肾脏所需要的能量主要通过补充葡萄糖维持，其余一些肾脏存活工作所需的关键因子及能量营养物质还在探索过程当中。

后续实验应针对影响灌注时长的具体因素进行设计，同时因为实验用猪为商品化猪。在本研究中，每头猪的热缺血程度不一致，因此每例肾脏灌注的情况差异较大。但是猪的双侧肾为天然的对照，这为我们进行严谨的实验方案设计提供了可能性。接下来的研究重点将关注对肾脏灌注影响关键因素的探索，以及探究尿激酶对血栓肾脏的作用情况探究，同时也可以对肾脏进行肾祖干细胞灌注，观察肾祖干细胞对AKI 肾脏的修复作用。

综上所述，NMP 对AKI 肾脏可能具有一定的修复作用，其有望扩大供肾来源，提高终末期肾病患者的肾移植率以获得更好的预后和生活质量。结果显示肝肾联合的肾外观以及LAC 水平较单肾结果好，但是灌注时长、尿量以及病理结果并无优势。进一步的结论需要更多的例数进行支持。目前国内的肾脏体外常温机械灌注仍处于起步阶段，各种实验细节仍需完善。我们团队通过对猪肾体外常温机械灌注的初步探索，为后续的实验设计奠定了基础，提供了依据，也为国内同行提供一些新的研究思路。