交叉引物恒温扩增技术在初诊疑似肺结核患者诊断中的应用价值

蒋淑萍 刘昌伟 李斌 徐小琴 罗文基 余柏林 张月

目前，诊断肺结核主要依靠细菌学检测，方法有多种，如萋-尼抗酸染色法（acid-fast stain，AFS），此方法操作简单、快捷及经济，但敏感度较低，容易漏检；培养法是检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的金标准，但耗时较长，需1～2个月才能出结果，且极易受环境、人为操作等影响，同时后期还可能需要继续进行菌种鉴定，影响结核病的早期诊断；组织病理学检查虽有较高的准确性，但有创伤性；分子生物学技术能直接检测MTB特有的核酸序列，且操作方便、快速及敏感度和特异度高，是目前结核病诊断的发展趋势，但其价格昂贵，不适合基层医院普遍开展［1-3］。因此，探索一种更合适的早期诊断方法至关重要。交叉引物核酸恒温扩增技术（cross-priming amplification，CPA）是一种新型恒温扩增技术，具有操作简单、报告快速及相对便宜等特点，具有广泛应用前景［4-5］。以固体培养法为参照对CPA技术检测效能评价已见报道，但以液体培养法为参照进行评价罕见报道。为此，本研究通过以BACTEC MGIT 960（简称“MGIT 960”）液体培养法为参照，与AFS 法比较，评估CPA技术在MTB检测中的效能。

资料和方法

一、研究对象

1.一般资料：收集2020年1月至2021年5月在深圳市龙华区慢性病防治中心就诊的初诊疑似肺结核患者2507例，排除99例非结核分枝杆菌感染者，共纳入2408例进行分析。其中男1607例，女801例；年龄6～93岁，中位年龄［M（Q1，Q3）］为32（26～45）岁。纳入标准：（1）咳嗽、咳痰时间＞2周，自愿到院接受各项相关检查；（2）初诊疑似肺结核；（3）未经抗结核治疗；（4）能送检至少1份合格痰标本；（5）患者及家属知情并签订知情同意书。排除标准：（1）未同时进行3种方法检测者；（2）非结核分枝杆菌感染或定植者；（3）不自愿配合者；（4）检测期间，由于技术原因导致结果缺失者；（5）任一方法检测结果为无效者。（6）AFS阳性而MPB64抗原阴性者。

2.伦理：本研究经深圳市龙华区慢性病防治中心伦理委员会批准同意（［2020］03号）。

二、仪器与试剂

4%氧氧化钠（广东汕头西陇化工有限公司）；p H值6.8的磷酸缓冲盐溶液（无锡傲锐东源生物科技有限公司）；萋-尼抗酸染色试剂（上海皓信生物科技有限公司）；MGIT 960液体培养试剂（美国BD公司）；MTB抗原试剂盒（杭州创新生物检控技术有限公司）；CPA检测试剂（杭州优思达生物技术有限公司）。

三、方法

1.标本采集：对患者进行留痰宣教后，患者自行留取就诊当日及时痰、夜间痰及就诊次日清晨痰共3份，每份2～5 ml，及时送检。收到标本后将3份标本混合成1份，然后同时采用AFS法、MGIT 960液体培养法及CPA技术进行检测。

2.AFS法：参照《结核病实验室检验规程》［6］抗酸杆菌显微镜检查标准化操作程序进行。蓝色背景下抗酸杆菌呈红色，连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌为阴性；发现3～9个/300个视野或更多为阳性。

3.MGIT 960 液体培养法：严格按照MGIT 960系统操作说明书进行操作，培养时间设定为42 d。仪器报告阳性后，即取培养液进行抗酸染色及MPB64抗原检测。若抗酸染色和MPB64抗原检验均阳性者则为培养阳性；若二者全部为阴性或抗酸染色阴性和MPB64抗原阳性者，判为污染菌，需将培养液当标本消化处理后再培养；若抗酸染色阳性而MPB64抗原阴性者则疑似非结核分枝杆菌，本研究予以排除。仪器培养42 d后报阴性者则为培养阴性。

4.MPB64抗原检测方法：取待鉴定的液体培养液100μl滴至检测板样本检测区，15～60 min内观察检测结果。检测线（T）和质控线（C）均出现紫红色条带者为阳性，检测线（T）没出现紫红色条带而质控线（C）出现紫红色条带者为阴性，质控线（C）没出现紫红色条带者均需重新检测。

5.CPA 技术：采用Easy NAT 恒温扩增-试纸条法试剂盒及核酸提取试剂对MTB-DNA 进行提取，操作均严格按照说明书要求进行。若痰液标本黏稠度较高，取适量标本以4%NaOH 消化（根据黏稠度加入1～2倍），然后进行离心、生理盐水洗涤、加核酸提取试剂及100℃金属浴等处理，得到上清DNA模板，然后取DNA模板液于玻璃化反应体系管中进行核酸恒温扩增，完成后取出反应管置入一次性防污染检测装置，扣紧进行检测，1～2 min读取结果。结果判断标准：（1）阳性：质控线（C）和检测线（T）同时显色，或仅出现T线显色，这表明样本中含有MTB，且含菌量已达到或超出了试剂盒的最低检出限。（2）阴性：仅C线显色，这表明样本中并不含有MTB 或其含菌量未达到试剂盒最低检出限。（3）无效：C线和T线均未显色，这表明操作有误、试剂盒受损或有扩增抑制物，如遇此情况，需要查明导致结果无效的原因，重新检测。

6.相关指标计算：敏感度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%；阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%；符合率=（真阳性例数+真阴性例数）/患者总例数×100%。

7.质量控制：痰检质量室间质量评价由北京结核病诊断技术创新联盟以及深圳市慢性病防治中心组织进行，质评结果全部合格。室内质控2020年涂阳培阴率为0.25%，液体培养污染率为7.93%，CPA检测无效率0。

8.观察指标：不同方法MTB阳性检出率、敏感度、一致性及培养阳性时间与敏感度的相关性。

四、统计学处理

应用SPSS 21.0统计学软件处理数据。计数资料采用“百分率（%）”描述，差异性比较采用χ2检验；非正态性计量资料以”中位数（四分位数）”描述；结果一致性采用Kappa检验，Kappa值≥0.75为一致性很好，0.40≤Kappa值＜0.75为一致性较好，Kappa值＜0.40时为一致性较差；相关性采用卡方趋势性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、三种方法MTB阳性检出率比较

AFS法、MGIT 960液体培养法及CPA技术MTB阳性检出率分别为8.89%（214/2408）、27.99%（674/2408）及15.49%（373/2408），不同方法之间差异有统计学意义（χ2=314.619，P=0.000），其中MGIT 960液体培养法明显高于CPA技术和AFS法，而CPA 技术高于AFS法，差异均有统计学意义（χ2=110.572，P=0.000；χ2=292.158，P=0.000；χ2=49.046，P=0.000）。

二、CPA技术检测效能评估

以MGIT 960 液体培养结果作为参照标准，CPA检测MTB的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及符合率分别为52.37%、98.85%、94.64%、84.23%及85.84%（2067/2408），而AFS法分别为31.45%、99.88%、99.07%、78.94%及80.73%（1944/2408），其中CPA技术的敏感度明显高于AFS 法，差异有统计学意义（χ2=108.290，P=0.000）。以MGIT 960液体培养结果为参照标准，CPA技术与MGIT 960液体培养法一致性较好（Kappa=0.592），而AFS法较差（Kappa=0.395）。同时AFS法阳培阴率为0.08%（2/2408），培养污染率为5.40%（130/2408），而CPA 检测无效例数为0（表1）。

表1 以MGIT 960液体培养结果为参照评估CPA技术检测MTB效能

三、CPA检测敏感度与培养报阳时间相关性

MGIT 960液体培养报阳时间为3～42 d，中位数（四分位数）为14（10，19）d，其中68.10%的标本报阳在7～19 d，而CPA 检测敏感度随培养报阳时间增加而降低。经趋势性卡方检验，CPA 敏感度随培养报阳时间的增加而呈下降趋势（Z趋势=257.788，P=0.000），两者呈负相关（r=-0.988，P=0.000）（表2）。

表2 CPA检测敏感度与MGIT 960液体培养报阳时间相关性

讨 论

结核病是由MTB感染，并经呼吸道传播的一种严重慢性传染性疾病。随着人们在饮食习惯和作息时间的改变及社会压力剧增等因素的共同影响下，人体免疫力下降，从而导致近年来结核病发病率呈持续上升趋势，且年轻化。MTB感染潜伏期长达4～8周，早期无任何临床症状或症状轻微，易被疏忽，确诊时病情已发展到活动阶段，错过了最佳的治疗时机，严重影响患者及时诊断、治疗及传播防控［7-9］。因此，加强结核病早期诊断对控制病情发展及传播至关重要。

CPA是我国自主研发的第一个具有自主知识产权的体外核酸扩增技术，主要包括玻璃引物、交叉引物、探针及具有链置换功能的DNA 聚合酶，针对MTB特异性基因片段进行扩增，然后利用免疫层析乳胶标记的试纸条进行检测，能排除非结核分枝杆菌的影响，而AFS法则不能，从而提高CPA 技术检测效能［10-12］。本研究结果显示，以MGIT 960液体培养结果为参照，CPA 技术MTB 阳性检出率（15.49%）明显高于AFS法（8.89%），但CPA 技术的MTB阳性检出率明显低于MGIT 960液体培养法（27.99%），而特异度高，这可能与CPA技术最低检测下限和检测原理有关。同时CPA 技术检测MTB的敏感度（52.37%）明显高于AFS法（31.45%），差异有统计学意义，与刘兰瑞等［2］的研究结果基本一致，且CPA技术与MGIT 960液体培养法检查结果一致性（Kappa=0.592）明显好于AFS法（Kappa=0.395），这表明CPA 技术在初诊疑似肺结核诊断中与AFS法比较有较高的敏感度和一致性，可提高MTB阳性检出率。另外结果显示，AFS法阳培阴率为0.08%及MGIT 960液体培养法培养污染率为5.40%，但未发现CPA 技术检测无效案例，且CPA技术检测全过程只需要2 h，可与AFS法相媲美。

有研究表明，以固体培养法结果为参照，CPA技术检测MTB的敏感度约为84.1%～100%。本研究结果显示，以MGIT 960液体培养结果为参照，CPA技术检测MTB的敏感度仅有52.37%，明显低于以固体培养法结果为参照的CPA 技术的敏感度，这可能与MGIT 960液体培养法的培养敏感度比固体培养法检出能力更高，能将MTB含菌量更低的标本培养出阳性等有关［13-16］。另外，有研究表明，液体培养检出阳性结果时间与痰中分枝杆菌的数量有关，标本含菌量越低，报阳时间越长［17］。本研究结果显示，MGIT 960液体培养中位报阳天数为14 d，68.10%的标本在7～19 d内报阳，与其他报道存在一定差异［18-21］，这可能与不同地区标本中MTB含量不同有关。同时CPA敏感度随培养报阳时间的增加而呈下降趋势（Z趋势=257.788，P=0.000），且两者呈负相关（r=-0.988，P=0.000），这表明CPA技术检测MTB的敏感度与标本中的MTB含菌量有关。此外，本研究收集了49 份MGIT 960液体培养阳性而CPA 阴性标本，逐级增加标本量进行检测，其中14份标本由阴性转变为阳性，有些甚至痰量增加到7 ml才出现阳性，从而可以推测对于CPA技术结果阴性而又高度怀疑结核病患者，可通过增大检测标本量，并对其进行消化和梯队浓缩的方案在一定程度上能提高CPA 技术检出效能。

综上所述，CPA 作为一种新型分子检测方法，在初诊疑似肺结核诊断中与AFS法比较有较高的阳性检出率、敏感度、特异度和一致性。同时CPA技术不需价格高昂的特殊设备，检测过程中不会产生有害物质造成二次污染，且操作简单方便、快速及经济，具有较高的临床应用价值，但其试剂盒检测下限有待提高。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献蒋淑萍：实验设计、实施研究、采集数据、分析/解释数据、统计分析、起草文章及审阅、获取研究经费、技术支持；刘昌伟：实验设计、分析/解释数据、审阅、统计分析、行政及技术支持与指导；李斌：实施研究、采集数据、分析/解释数据、审阅、行政及材料支持；徐小琴、罗文基、余柏林及张月：实施研究、采集数据、分析/解释数据及审阅