肺炎链球菌血清型监测结果与疫苗覆盖情况

王颖童 何宝花 张海霞 曹玉雯 贾肇一 孙印旗

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)是常见的条件致病菌之一，正常情况下可寄生于口咽和鼻咽，其引起的细菌性肺炎是社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的重要组成部分，国外报道中占CAP的15%～23.4%[1,2]。Spn在宿主免疫力下降时还可引发脑膜炎、败血症等侵袭性疾病(invasive pneumococcal disease,IPD)。Spn细胞壁上的细菌荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)可保护菌体逃避宿主先天免疫反应，使病原菌可在宿主体内繁殖增长。根据CPS组成和结构不同，Spn可分为近100种血清型[3]，其中与IPD相关的仅有20余种，包括14，4，1，6，7F，23F，18C，19F等[4]。监测血清型别变迁和漂移有利于相关疾病的防控和诊疗。为抵御肺炎链球菌感染23 价肺炎链球菌多糖疫苗 (23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine,PPV23)首先研发，但其对<2岁儿童保护效果不理想[5]，继而陆续研发了多种肺炎链球菌结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine,PCV)PCV7、PCV10、PCV13等。本研究旨在了解2014至2018年河北省儿童病例来源肺炎链球菌血清型分布特点，分析各型疫苗覆盖率和应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 本实验所用肺炎链球菌为2014至2018年收集的儿童病例来源菌株累计527株，其中按时间统计包括2014年182株、2015年123株、2016年111株、2017至2018年111株(2017和2018年收集菌株数量较少，为使计算结果、讨论趋势时组间基数相对平衡，将2年的数据合并为一组)。527株样品菌株分离来源包括：脑脊液、全血、硬膜下积液、胸水、各种穿刺液、痰、分泌物等部位。其中侵袭性菌株192株，占比36.43%，非侵袭性菌株335株，占比63.57%。采样病例中男335例，女192例，性别比1.74∶1；年龄分布为：<12个月253例、12～24个月163例、>24个月111例。全部菌株已使用PCR检测肺炎链球菌特异基因cpsA进行复核。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器：生物安全柜(型号：NU-430-600E)产自美国NUAIRE公司；CO2恒温培养箱(型号：MCO-18AIC)产自日本SANYO公司；比浊仪(型号：DENSIMAT)产自法国梅里埃公司；核酸提取仪(型号：NP968-C)产自中国天隆科技有限公司；PCR扩增仪(型号：DNA Engine PTC-200)产自美国Bio-Rad公司。

1.2.2 主要试剂与耗材：哥伦比亚血平板BAP产自英国OXOID公司，扩增血清型引物由华大基因公司合成，细菌DNA提取试剂盒产自天隆科技有限公司。

1.3 DNA模板的提取 根据DNA提取试剂盒说明书，选取新鲜复核的纯培养Spn菌株；使用无菌0.9%氯化钠溶液配制菌悬液100 μl，13 500×g离心2 min，弃上清；沉淀物中加入溶菌酶180 μl、蛋白酶K20 μl，涡旋混匀，50℃条件下水浴30 min；再加入菌体消化液200 μl，充分混匀；上机，按照既定程序提取细菌基因组DNA。

1.4 多重PCR实验方法

1.4.1 引物的合成：根据WHO《Laboraory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,and Haemophilus influenzae》手册推荐的多重PCR扩增方法鉴定菌株血清型。引物参考美国疾病控制与预防中心官网(https://www.cdc.gov/streplab/pcr.html)公布的序列。

1.4.2 实验顺序：按照WHO实验手册推荐，将所有引物分成8个反应组(G1～G8)，G1：6(6A/6B/6C/6D)、19A、16F、3、22F/22A，G2：15A/15F、23A、7F/7A、8、33F/33A/37，G3：19F、35B、12F/12A/44/46、11A/11D、38/25F，G4：18(18A/18B/18C/18F)、24(24A/24B/24F)、7C/7B、4、9V/9A，G5：23F、14、1、10A、15B/15C，G6：5、35F/47F、39、10F/10C/33C、17F，G7：34、23B、35A/35C/42、9N/9L、31，G8：20、13、21、2。所有样本DNA按照G1～G8的顺序进行实验，已经分型成功的样本不再进行下一组实验。所有组别均未检出阳性的样本，判定为未分型。

1.4.3 反应体系和循环条件：反应总体系50 μl，包括：Master Mix(2×)25 μl；Primer F/R(25 μmol/L)变化；DNA模板5 μl，剩余体积由ddH2O补足。扩增条件：预变性95℃ 15 min、变性94℃ 30 s、退火54℃ 90 s、延伸72℃ 60 s，共循环30次个；再延伸72℃ 10 min。

1.4.4 结果判读：通过普通电泳，条件设定为120 V、70 min，观察 PCR实验条带，根据实验手册给出的相应基因特异性条带片段大小，研判分型结果。

1.5 统计学分析 应用SPSS 23.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，两两比较采用Bonferroni检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株血清型总体分布情况 全部527株菌株中，除40株未分型之外，其他菌株共被分为29个血清型，其中数量较多的包括：19F(176株33.40%)、6(87株16.51%)、19A(57株10.82%)、14(30株5.69%)、23F(20株3.80%)、3(17株3.23%)、1(13株2.47%)、20(13株2.47%)，以上菌株总计413株，达到样本总量的78.37%。(虽然TC/TB/40型也达到17株，但目前的实验方法不能精确分型到具体型别；故暂不做比较和讨论)比较前五种优势血清型在侵袭性和非侵袭性菌株中的比重发现，19F型、19A型在非侵袭性菌株的比例明显高于侵袭性(χ2值分别为18.03、3.89，P<0.05)；14型在侵袭性菌株中的比例明显高于非侵袭性菌株(χ2=22.24，P<0.01)；6和23F差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2014至2018年儿童肺炎链球菌菌株血清型分布情况

2.2 优势血清型年度变化规律 汇总主要血清型在几年中的占比变化发现，19F型一直处于较高位置，但2015年达到高点后出现下降趋势；19A型2015、2016年出现短时降比，之后又在2017至2018年收集的菌株回升至前期水平；6群在2017至2018年出现了比例下降，而与之形成鲜明对比的是14型在同时间段出现比例明显上升。23F型因其总数量仅20株，年度占比一直徘徊在5%左右。3型、1型、20型的总数量更低，未能发现明显的变化趋势。见表2,图1。

表2 主要血清型肺炎链球菌菌株年度占比 %

2.3 疫苗覆盖情况 PCV7、PCV10、PCV13、PPV23的总体覆盖率依次为60.34%、64.33%、78.37%、83.30%。4种疫苗间差异有统计学意义(χ2=93.89，P<0.01)，但进一步使用Bonferroni检验(两两比较)发现PCV7与PCV10间差异无统计学意义(P>0.05)，PCV13与PCV23间差异无统计学意义(P>0.05)；PCV7和PCV10分别与PCV13和PCV23比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。在侵袭性和非侵袭性菌株中的覆盖率，PCV7疫苗在侵袭性菌株中的覆盖率明显高于非侵袭性(χ2=16.57，P<0.001)。PPV23在>2岁儿童来源菌株中的覆盖率为87.93%，与其在全体菌株中的83.30% 接近。见表3，图1。

表3 PCV7、PCV10、PCV13、PPV23疫苗覆盖情况汇总

图1 主要血清型肺炎链球菌菌株年度比重变化

3 讨论

本研究收集到的5年样本中可分型菌株内部，19F和6群是主要血清型，此结果与冯爽等[6,7]研究一致。与某些报道认为的引起侵袭性疾病以19F、19A型较为常见的结论不同[8]，本研究中非侵袭性Spn中19A占第三位，但在侵袭性菌株紧随19F和6群之后的是14型。

无论19F型或19A型在非侵袭性菌株中的占比水平均显著高于它们在侵袭性菌株的占比水平。提示可能两型导致的临床症状会有减轻趋势。观察年份分布发现，19F型近年来呈现下降趋势；而19A型在2017至2018年明显回升。19F和19A存在型别互换的可能性，原因是荚膜在合成过程中可发生遗传物质层面的互换[9]。19A占比的显著上升，不能排除19F部分漂移为19A型的可能性。但由于19A的数量距离19F相差较远，不能扭转整体下降的趋势。提示19F、19A作为主要Spn血清型的优势正在缩小。

无论在侵袭性还是非侵袭性菌株中6群占比都处于第二位，年度变化来看相对稳定。6群在日本报道中占流行血清型首位[10]，其国外报道中其6群也被认为是耐药性最高的血清型之一[11]。其比例下降也可能与PCV7的接种有关。

14型菌株数量在2017至2018年收集到的样本中显著上升，且14型在侵袭性菌株中整体占比超过了19A型，与陈凯乐等[7]的结果相近。14型在侵袭性菌株中占比也显著高于其在非侵袭性菌株中的比例，可能提示其所致症状相对较重。国外曾报道14型为亚非欧美多地区常见致病血清型[12]、14型在所有年龄段患者分离的Spn菌株中所占比重均是最高的型别之一[13]，不排除其在今后比例继续上升的趋势，应引起高度重视。

23F型在本研究中比重排名第五，但总体数量仅20株。与之不同的是，在国内其他研究中，其数量与6群接近甚至更高，提示23F型的占比存在地区差异[6,14]。

本研究中PCV7、PCV10、PCV13的5年综合覆盖率为60.34%、64.33%、78.37%，低于欧洲地区、北美地区和哥伦比亚的研究数据[15,16]。本组数据显示，PCV7、PCV10、PCV13三种疫苗覆盖的血清型是逐级增多的，但统计发现，PCV7与PCV10间差异无统计学意义(P>0.05)，可能与PCV10仅增加覆盖1、5、7F这些小众型别有关。

相对而言，PCV13的覆盖率相对于前二者则显著上升，分析可能与其涵盖了数量较多的19A型关系较大。PCV13可显著改善保护效果的结论，在前期报道中也屡有出现。数据显示，英格兰、威尔士地区发现其可使IPD发病率降低32%[17]，瑞典发现PCV13可显著降低<2岁婴幼儿肺炎的发生率[18]，美国应用PCV13 2年后<2岁婴幼儿肺炎链球菌肺炎住院率显著下降[19]。可见PCV13疫苗在实际应用中更为推荐。PCV7作为前期研发的结合疫苗，曾在世界范围内对儿童链球菌感染类疾病的发病率下降产生过重大影响[20]；且曾有研究发现PCV7可显著降低IPD发病率[21]，与之相呼应，本研究也发现PCV7在侵袭性菌株中的覆盖率高于非侵袭性。但是由于疫苗选择性压力等原因造成的血清型替换，近年来本地收集到的菌株中，PCV7的保护率显著低于PCV13，结合19F型菌株数量下降，不排除会导致PCV7的保护效果下降的可能性。故仍更加推荐使用PCV13替代PCV7和PCV10。

PPV23可以直接诱导人体内B细胞产生血清型特异性IgM和IgG2抗体，不产生免疫记忆，这些抗体与Spn荚膜多糖特异性结合，促进巨噬细胞和中性粒细胞对细菌的吞噬作用[22]。在《肺炎球菌性疾病免疫预防专家共识》(2017年)中PPV23疫苗被推荐主要应用于>2岁感染Spn或患有PD(肺炎球菌性疾病Pneumococcal Disease)的高风险人群[23]，原因是<2岁儿童免疫系统发育不健全，不能产生保护性免疫应答[22]。本研究中PPV23覆盖率同样显著高于PCV7和PCV10，但不高于PCV13，在侵袭性和非侵袭性菌株间也无覆盖率的显著差异，可见对于>2岁儿童，使用PCV13和PPV23均可。

综上所述，在可分型的菌株中，优势血清型依次为：19F、6、19A、14、23F型。19F型和19A型对本地肺炎链球菌引起感染的比重和症状都有可能存在下降或减轻的趋势，相反6群和14型可能上升或加重。预防肺炎链球菌性疾病，推荐使用PCV13替代PCV7和PCV10，不受年龄限制。根据儿童生理特点，>2岁儿童还可注射PPV23进行预防，与注射PCV13相比暂无显著效果差异。