紫花苜蓿品种苗期耐盐性分析及评价指标筛选

余如刚， 王雪茄， 王国良， 徐智明， 高晴晴， 杜雪玲， 张宇龙

(1. 淮北师范大学生命科学学院， 安徽 淮北 235000； 2. 山东省农业科学院休闲农业研究所， 山东 济南 250010；3. 秋实草业有限公司， 安徽 五河 233300； 4.安徽省农业科学院， 安徽 合肥 230031)

土壤盐渍化面积逐年增加已成为全球范围内的农业生态环境问题之一[1]。盐胁迫负调控植物的生长过程，包括植物的光合作用、呼吸作用及新陈代谢发生等，从而抑制植物的生长，甚至导致死亡[2-3]。提高盐渍化土壤的利用率已成为紧迫的全球性生态环境关注热点。前人研究发现，种植耐盐性较高植物不仅可以利用盐渍化土壤，而且也提高土壤修复能力[3-4]。因此，筛选和开发更多耐盐植物种质资源是利用和治理盐渍化土壤的有效生物方法。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)属豆科蝶形花亚科苜蓿属的多年生优质牧草，富含粗蛋白质、维生素和多种矿物质元素，被誉为“牧草之王”，并具有适应性和抗逆性强等特点。随着我国膳食结构的转变，肉、蛋和奶等动物源食品逐渐成为食物的重要组成部分，随之而来对养殖所需的优质牧草，特别是紫花苜蓿的需求量也大幅增加。然而，目前国产苜蓿无法满足国内市场需求，仍需大量进口国外苜蓿。同时，国内有限的耕地资源在保障口粮供给的基础上，难以用于大规模种植苜蓿，成为制约苜蓿产业发展的重要因素。研究发现，紫花苜蓿与其他牧草相比，具有较高的耐盐性和改良土壤盐渍化的作用[5-6]，是一种理想的修复和利用盐渍化土壤的首选植物。但是，紫花苜蓿是同源四倍体，具有很高的遗传复杂性，不易培育新品种，且不同品种间耐盐性存在显著差异[7-11]。因此，在有限的耕地资源条件下，挖掘紫花苜蓿本身耐盐性强的种质资源，筛选和培育耐盐紫花苜蓿品种，不仅能有效改良和利用盐渍化土地，而且有利于促进畜牧业发展。此外，不同的紫花苜蓿品种在不同的生育期对盐胁迫的耐性具有显著差异，幼苗期是其对盐胁迫较为敏感的时期之一[12]。由于植物对盐的耐受性是一个复杂的综合性状，因此，近年来耐盐种质资源筛选的方法多基于多指标综合评价方法，包括主成分分析法、隶属函数法和回归分析等多元分析方法[13-14]。本试验以17个形态和生理指标的耐盐系数为基础，在NaCl胁迫下，通过多元分析方法对20个紫花苜蓿幼苗的耐盐特性进行综合评价，根据测定指标与耐盐特性的关系建立紫花苜蓿幼苗期耐盐评价数学模型，以期为耐盐紫花苜蓿种质资源评价及新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验材料由山东省农业科学院休闲农业研究所、秋实草业有限公司、北京克劳沃生态科技有限公司和北京阳光绿地生态科技有限公司提供，共计20个紫花苜蓿品种(表1)。

表1 供试紫花苜蓿品种及来源Table 1 The origins of M. sativa L. varieties in test

1.2 试验设计

盆栽试验于2020年9—11月在淮北师范大学园艺专业实训基地进行。挑选大小一致的种子，置于铺两层滤纸培养皿中，暗培养4天后，将已发芽且长势一致的紫花苜蓿转移至口径13 cm高12 cm的营养盆中。为避免在收苗时伤害到幼苗的根系，采用清洗干净的河沙作为培养基质，晒干河沙1.2 kg/盆。移苗后每间隔1 d浇100 mL自来水。出现真叶时，每间隔1 d浇100 mL霍格兰营养液；每盆留长势一致的幼苗10株。缓苗生长2周后进行盐胁迫，共设置3个处理：无NaCl的霍格兰营养液(对照)、150 mmol·L-1和300 mmol·L-1NaCl浓度的霍格兰营养液处理；其后，每间隔1 d浇含不同浓度NaCl(0,150和300 mmol·L-1)的霍格兰营养液100 mL。试验期间每盆添加营养液均为上午和下午各50 mL。每品种各处理设3个生物学重复。盐处理5周后，统计成活率，并分别取根、茎和叶样品进行形态和生理指标测定。

根据观察不同浓度NaCl处理下紫花苜蓿形态特征，发现JG,GN3和ST在300 mmol·L-1NaCl处理5周后植株叶片萎蔫，有的甚至死亡。因此，本研究仅以150 mmol·L-1NaCl处理下各指标评价不同品种紫花苜蓿的耐盐特性。

1.3 指标测定

1.3.1形态指标测定 盐处理5周后从每盆随机选取3株长势一致的幼苗，用直尺测量基质表面到植株最顶部的距离作为株高(PH)；取样时，每盆取3株，将根、茎和叶分开，利用直尺测量最长根长(LRL)；通过人工计数单株叶片数(LN)；分别称量茎鲜重(SFW)、叶鲜重(LFW)和根鲜重(RFW)；然后，放于105℃烘箱中杀青1 h，再在70℃条件下烘干至恒重，分别称量茎干重(SDW)、叶干重(LDW)和根干重(RDW)。其他生长指标计算公式如下：

地上部鲜重(AFW)=茎鲜重+叶鲜重

总鲜重(TFW)=茎鲜重+叶鲜重+根鲜重

地上部干重(ADW)=茎干重+叶干重

总干重(TDW)=茎干重+叶干重+根干重

1.3.2生理指标测定 以叶片为研究对象，分别测定对照和150 mmol·L-1NaCl处理下各项生理指标。丙二醛含量的测定参照张志良等的方法[15]。叶绿素含量采用手持叶绿素仪SPAD-502Plus进行测定；光合荧光参数F0和Fm采用FluorPen手持式叶绿素荧光仪进行测定，进一步计算可得量子产额，表示光系统Ⅱ的效率，等于Fv/Fm(暗适应状态)或Yield(光适应状态)。

Fv/Fm= (Fm-F0)/Fm

Yield=(Fm′-F0′)/Fm′

1.4 综合评价及数据分析

利用Microsoft Excel 2010进行原始数据处理。采用IBM SPSS 25.0软件进行主成分分析、相关性分析、聚类分析和逐步回归等分析。具体指标计算如下[13-14]：

(1)测定指标的耐盐系数

各单项指标的耐盐系数(STC)=
盐胁迫处理测定值/对照处理测定值

①

(2)不同紫花苜蓿品种各综合指标的隶属函数值U(Xi)

②

式中，Xi表示第i个综合指标；U(Xi)表示第i个综合指标的隶属函数值，Xi max和Xi min分别表示20个品种中第i个综合指标的最大值和最小值。

(3)不同基因型紫花苜蓿品种综合指标的权重(Wi)

③

式中，Wi表示第i个综合指数的相对重要性，即第i个综合指数的权重，Pi表示第i个综合指数的贡献率。

(4)不同基因型紫花苜蓿品种的综合耐盐性评价值

④

式中，D值为各紫花苜蓿品种在盐胁迫条件下由综合指标评价分析后获得的耐盐性综合评价值。为了获得各紫花苜蓿品种更科学合理的耐盐类别，利用最小距离准则对综合评价D值进行系统聚类分析。同时，为了分析各单项指标与耐盐性之间的关系，筛选准确的耐盐鉴定指标，探讨可用于预测紫花苜蓿耐盐性评价的数学模型，将各指标的胁迫耐性系数与D值进行相关性分析，以显著相关指标(P<0.05或P<0.01)的胁迫耐性系数作为自变量，综合评价值(D值)作为因变量进行逐步回归分析，建立最佳评价数学模型。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿品种幼苗存活率分析

存活率一般是鉴定植物耐盐性的一个重要指标。本研究发现在对照和150 mmol·L-1NaCl处理下，各品种存活率均接近100%。因此，本试验仅统计300 mmol·L-1NaCl处理下各品种的存活率。由图1可知：存活率大于60%的品种有GN5,XL,JNG,TG,JN和JS；存活率在60%～40%的品种有JN995,ADN,GN9,HG,POW,SG,JN801,JL,SH和LS；存活率在40%～20%的品种有JG和INS，存活率小于20%的品种有ST和GN3。由此，我们推测GN5,XL,JNG,TG,JN和JS为耐盐品种，ST和GN3高感品种。

图1 300 mmol·L-1 NaCl处理下20个紫花苜蓿品种幼苗存活率Fig.1 Seedling survival rate of 20 M. sativa L. varieties under 300 mmol·L-1 NaCl treatment.

2.2 各单项指标的耐盐系数及相关性分析

耐盐系数能够较好显示各指标在处理与对照条件下比较的结果。由表2可知：各单项指标的耐盐系数在20个紫花苜蓿品种间变化显著。变异范围为8.90%～78.90%，其中，丙二醛的变异系数最大，变异系数较大的为茎鲜重、叶鲜重、地上部鲜重、叶片数和总鲜重指标，说明盐胁迫对这些指标的影响较大。不同紫花苜蓿品种经盐处理后，13个形态指标值：株高、最长根长、根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、地上部鲜重、总鲜重、根干重、茎干重、叶干重、地上部干重、总干重和叶片数与对照比均有所下降(STC<1)，说明各品种在盐胁迫下生长均受到不同程度抑制。盐处理后生理指标值与对照比则在不同品种中呈不同程度的变化(STC>1或STC<1)。NaCl胁迫下各单项指标的变化幅度不同，依据任何一个单项指标均难以准确、直观地评价其耐盐性，因此，需要多指标综合评价。

表2 150 mmol·L-1 NaCl处理下20个紫花苜蓿品种测定指标的耐盐系数Table 2 The salinity tolerance coefficients of tested indices of 20 M. sativa L. varieties under 150 mmol·L-1 NaCl treatment

从17个单项指标耐盐系数的相关性分析来看：除了株高、丙二醛含量和黑暗下量子产额外，其他每一个单项指标至少与其他1个或1个以上的单项指标显著或极显著相关，其中，最长根长与茎干重、总干重、叶绿素呈显著性正相关，根鲜重与茎鲜重、叶鲜重、地上部鲜重、总鲜重、茎干重和总干重等呈显著性相关，茎鲜重与叶鲜重、地上部鲜重、总鲜重、茎干重和总干重等呈显著性相关(表3)。从上述分析得知，这些单项指标之间的相关性，导致提供的评价信息发生重叠，从而影响了各紫花苜蓿品种耐盐性的筛选与鉴定。

表3 150 mmol·L-1 NaCl处理下紫花苜蓿幼苗各单项指标的相关系数矩阵Table 3 Correlation matrix of each single index of M. sativa L. seedlings under 150 mmol·L-1 NaCl treatment

2.3 耐盐系数的主成分分析

以不同紫花苜蓿品种各单项指标的耐盐系数为基础，利用SPSS 25.0软件计算各主成分的特征向量和贡献率，并根据各特征向量的绝对值将不同指标划分到不同的主成分之中。同一指标在各因子中的最大绝对值所在位置即为其所属主成分。由表4可知：所转换的前5个综合指标(CI)的贡献率分别为53.40%，10.66%，8.58%，7.35%和7.08%，被分别定义为第1(CI1)至第5(CI5)主成分，累计贡献率达到87.07%，表明这5个综合指标能代表17个单项指标携带的绝大部分信息，因此，可以用这5个主成分指标对20个紫花苜蓿品种耐盐性进行分析。

表4 各综合指标的特征向量及贡献率Table 4 Eigen vectors and percentage of accumulated contribution of comprehensive index

2.4 紫花苜蓿苗期耐盐性的综合评价

2.4.1隶属函数分析 利用公式(2)，求出不同紫花苜蓿品种各综合指标的隶属函数值(表5)。对于同一综合指标如CI1而言，盐处理下，GN5的U(X1)值最大，为1.0000，表明GN5在CI1综合指标中耐盐性最强，而LS的的U(X1)值最小，为0.0000，表明其该综合指标上耐盐性最弱。

表5 不同苜蓿品种综合指标隶属函数分析Table 5 Subordinate function analysis of comprehensive index in different M. sativa L. varieties

2.4.2耐盐性的综合评价及聚类分析 利用公式(3)，计算5个综合指标的权重，分别为0.6133,0.1224,0.0986,0.0844和0.0813(表5)。利用公式(4)，求出不同紫花苜蓿品种的耐盐性综合评价值(D值)(表5)，依据D值对不同紫花苜蓿品种的耐盐性强弱进行排序，D值最高的为GN5(0.8269)，表明其耐盐性最强；D值最低的为LS(0.1400)和HG(0.1447)，表明其耐盐性最弱。对D值进行系统聚类分析，20个紫花苜蓿品种分为5类：高度耐盐类型(GN5)、耐盐类型(SH,ADN,ST,TG,SG,JL和JN801)、中度耐盐类型(JS,INS,POW和JNG)、盐敏感类型(JN,JN995,GN9,GN3,XL和JG)和高敏感类型(HG和LS)(图2)。

图2 20个紫花苜蓿品种D值聚类树状图Fig.2 The deprogram of clusters for 20 M. sativa L. varieties based on D value

2.5 回归分析及耐盐鉴定指标的选择

为分析各单项指标与耐盐性之间的关系，筛选出可靠的耐盐鉴定指标，探讨可用于耐盐性评价的数学模型，以耐盐性综合评价值D值作为因变量，以与D值显著相关的指标：根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、地上部鲜重、总鲜重、根干重、叶干重、地上部干重、总干重、叶片数、叶绿素和光照下的量子产额为自变量进行线性逐步回归分析(表6)，建立耐盐评价数学模型：D′=-0.284+1.342×ADW+0.182×LN (R2=0.967，P=0.001)，并筛选出2个指标对紫花苜蓿苗期耐盐性有显著影响，分别为地上部干重和叶片数。利用该数学模型对20个紫花苜蓿品种进行综合评价，平均估算精度为93.35%(表7)。

表6 逐步线性回归分析结果Table 6 The results of stepwise linear regression analysis

表7 回归方程的估计精度分析Table 7 Analysis of evaluation accuracy of equation

3 讨论

紫花苜蓿是牲畜均喜食的优质牧草，但中国耕地资源紧缺，次生盐渍化耕地面积逐年增加，有限的耕地资源在保障口粮供给的基础上[16]，难以用以大规模种植紫花苜蓿。但是紫花苜蓿具有一定的耐盐能力，因此，筛选和开发更多的优质耐盐紫花苜蓿品种不仅有利于盐碱地的有效利用，而且对畜牧业发展起到一定的助力作用。

植物生长易受盐胁迫的抑制，已有研究表明，盐胁迫指的主要是含有NaCl和Na2SO4的盐渍土，其中，NaCl是盐渍土组成中含量最大，迁移能力最强，最活跃的盐分之一[17]，因此，本研究以NaCl作为盐处理具有一定的合理性和代表性。紫花苜蓿的耐盐筛选已有研究，Maas和Hoffman[18]报道紫花苜蓿苗期产量在8.9 dS·m-1(≈ 97 mmol·L-1NaCl)时下降50%。李明雨等[19]认为1.2%(≈205 mmol·L-1)NaCl浓度为苜蓿耐盐性鉴定的适宜浓度。基于以上，为了筛选高度耐盐紫花苜蓿品种，本研究设置3个NaCl(0，150 和300 mmol·L-1)处理水平，其中，300 mmol·L-1NaCl胁迫下，各品种植株均出现不同程度萎蔫和死亡现象，有些评价指标难以测定，因此，最终选择150 mmol·L-1NaCl作为本研究的筛选浓度。不同的紫花苜蓿品种间耐盐性差异很大，不同生育时期的耐盐性也不尽相同，幼苗期是紫花苜蓿对盐胁迫较为敏感的时期[12]。盐胁迫对不同苗期指标的影响也不尽相同。目前紫花苜蓿苗期耐盐性筛选指标并没有统一的标准，但有研究表明，盐胁迫下株高和生物量在紫花苜蓿各品种间差异很大，可以作为指示紫花苜蓿苗期盐胁迫响应的指标[12,19]；张则宇等[20]对59份紫花苜蓿品种进行苗期耐盐筛选，结果发现盐胁迫下苗期的叶面积、叶绿素荧光、叶绿素含量和根冠比可作苗期耐盐性鉴定指标。田小霞等[21]通过叶绿素含量、单株绿叶数、苗高和叶片相对电导率等4个指标以及Yu等[13]通过地上部鲜重、地上部干重、鲜重根冠比和K+/Na+等4个指标建立数学评价模型，为筛选紫花苜蓿耐盐性提供了评价指标。同时，已有研究表明作物耐盐性筛选中，任何单一指标均不能准确、直观地评价其耐盐性，因此需要多指标来全面的进行紫花苜蓿耐盐性评价。研究显示利用主成分分析、隶属函数法及回归分析等多元分析方法已成为作物耐盐性品种筛选的一种可靠、有效的方法[13,20-23]。本研究选择13个形态指标和4个生理指标进行测定，并运用多元分析方法对20份紫花苜蓿苗期耐盐性进行综合评价。

耐盐系数显示了对照和盐处理品种在各项指标上的比较结果，它通常被用作评价作物耐盐性的标准[7,9,13,20-23]。本研究以17个单项指标的耐盐系数为基础，利用主成分分析，将17个单项指标转换为5个相互独立的综合指标，并得到不同品种紫花苜蓿苗期的耐盐性综合评价值(D值)，依据D值进行聚类分析，较为客观地筛选出1个高度耐盐、7个耐盐、4个中度耐盐、6个盐敏感和2个高度盐敏感紫花苜蓿品种。该结果与依据300 mmol·L-1NaCl胁迫下单一存活率指标的推测结果不一致，说明不能以单项存活率指标来进行紫花苜蓿耐盐性评价。同时，有3个品种GN3,XL和HG的评价结果与张则宇等[18]的研究结果相同，均为不耐盐类型。此外，通过逐步回归法建立了紫花苜蓿苗期耐盐性预测数据模型，该模型平均估算精度为93.35%，可用于筛选紫花苜蓿幼苗阶段不同品种的耐盐性。

4 结论

本研究将供试的20份紫花苜蓿品种分为高度耐盐(1个)、耐盐(7)、中度耐盐(4个)、盐敏感(6个)和高度盐敏感(2个)5个类型，其中GN5为高度耐盐型、SH为耐盐型、LS和HG为高度盐敏感型紫花苜蓿。建立了紫花苜蓿幼苗耐盐性评价数学模型D′=-0.284+1.342×ADW+0.182×LN (R2= 0.967，P= 0.001)，筛选出地上部干重和单株叶片数为紫花苜蓿苗期耐盐性鉴定指标。研究结果将为紫花苜蓿耐盐品种资源鉴定及良种选育提供科学支持。